基于“有故无殒”思想的醋甘遂毒性研究

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[摘要]目的：研究醋甘遂对正常和癌性腹水模型大鼠毒性的差异。方法：以正常和癌性腹水模型大鼠为研究对象，分组连续7d灌胃不同剂量醋甘遂，通过病理切片观察大鼠肝、胃、肠组织损伤情况，并考察其对大鼠血清、肝、胃、肠组织生化指标及氧化损伤指标的影响。结果：与空白组比较，各正常给药组及模型组大鼠肝、胃、肠组织均出现显著损伤。与模型组比较，各模型给药组损伤显著减轻。与空白组比较，模型组大鼠血清、肝脏中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）活力显著升高（P<0.01），血清及肝、胃、肠组织中谷胱甘肽（GSH）含量显著降低（P<0.01），丙二醛（MDA）含量显著升高（P<0.01）。与空白组比较，正常低、中、高剂量组大鼠血清中AST，ALT与肝脏中ALT及正常高剂量组大鼠肝脏中AST活力均显著增高（P<0.05，P<0.01）;正常低、中、高剂量组血清、胃组织中GSH及正常中、高剂量组肝、肠组织中GSH含量显著降低（P<0.05，P<0.01）;正常低、中、高剂量组肝组织中MDA及正常中、高剂量组血清、胃、肠组织中MDA含量显著升高（P<0.05，P<0.01）。与模型组比较，模型低、中、高剂量组大鼠血清中AST，ALT与模型中、高剂量组大鼠肝脏中AST及模型高剂量组大鼠肝脏中ALT活力均显著降低（P<0.05，P<0.01）;模型低、中、高剂量组血清及胃组织与模型中、高剂量组肝组织及模型高剂量组肠组织中GSH含量显著升高（P<0.05，P<0.01）;模型低、中、高剂量组血清与模型中、高剂量组肝组织及模型高剂量组胃、肠组织中MDA含量显著降低（P<0.05，P<0.01）。结论：醋甘遂对癌性腹水模型大鼠肝、胃、肠毒性较正常大鼠显著降低，为醋甘遂“有故无殒”的临床安全用药提供依据。

[关键词]有故无殒;醋甘遂;毒性差异

Studyontoxicityofvinegar-processedKansuiRadixonbasisof

symptom-basedprescriptiontheory

CAOLiang-liang1，WANGWen-xiao1，ZHANGLi1，DINGAn-wei1，DOUZhi-hua2*，WANGYu-hua1

（1.CollegeofPharmacy，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China;

2.NantongClinicalMedicalCollegeofIntegratedTraditionalChineseMedicineandWesternMedicine，

NanjingUniversityofChineseMedicine，Nantong226006，China）

[Abstract]Objective：Tostudythedifferencesinthetoxicityofvinegar-processedKansuiRadixonnormalandcancerousascitesmodelrats.Method：Normalandcancerousascitesmodelratsweretakenastheresearchobjectsandorallyadministeredwithdifferentdosesofvinegar-processedKansuiRadixfor7d.Pathologicalsectionswerepreparedtoobservethedamagesinliver，stomach，intestinaltissuesiatsanddetecttheimpactsonserum，liver，stomachandintestinaltissuesandtheoxidativedamageindex.Result：Comparedwiththeblankgroup，allofnormaladministrationgroupsandmodelgroupsshowedsignificantdamagesinliver，stomachandintestinaltissues.Comparedwiththemodelgroups，allofnormaladministrationgroupsrevealednotablealleviationindamages.Comparedwiththeblankgroup，themodelgroupsshowedsignificantincreasesinAST，ALTandMDAinserumandliver（P<0.01）andasignificantdecreaseinGSHinserumandliver，stomach，intestinaltissues（P<0.01）.Comparedwiththeblankgroup，theresultsshowedsignificantdecreasesinALT，ASTinserumandALTinliverinmodellow，mediumandhighdosegroupsandASTactivityinlivertissuesinthenormalhighdosegroup（P<0.05，P<0.01）;significantdecreasesinGSHinserumandstomachtissuesinnormallow，mediumandhighdosegroupsandGSHcontentinliverandintestinaltissuesinnormalmediumandhighdosegroups（P<0.05，P<0.01）;notablerisesinMDAinlivertissuesinnormallow，mediumandhighdosegroupsandMDAcontentinserumandstomachandintestinaltissuesinnormalmediumandhighdosegroups（P<0.05，P<0.01）.Comparedwithmodelgroups，datarevealedsignificantdecreasesinALT，ASTinseruminmodellow，mediumandhighdosegroups，ASTinlivertissuesofmodelmediumandhighdosegroupsandALTactivityinliverinthemodelhighdosegroup（P<0.05，P<0.01）;significantincreasesinGSHcontentinserumandstomachtissuesofmodellow，mediumandhighdosegroups，GSHinlivertissuesinmodelmediumandhighdosegroupsandGSHinintestinaltissuesinthehighdosegroups（P<0.05，P<0.01）;andnotabledeclinesinMDAcontentinseruminmodellow，mediumandhighdosegroups，MDAinlivertissuesofmodelmediumandhighdosegroupsandMDAinstomachandintestinaltissuesthehighdosegroup（P<0.05，P<0.01）.Conclusion：Accordingtothestudy，vinegar-processedKansuiRadixshowedasignificantlowertoxicityliver，stomach，andintestinesofcancerousascitesmodelrats，whichprovidedabasisforclinicalsafeapplicationofvinegar-processedKansuiRadixbasedonsymptom-basedprescriptiontheory.

[Keywords]symptom-basedprescription;vinegar-processedKansuiRadix;differencesintoxicity

doi：10.4268/cjcmm20151625

甘遂KansuiRadix为大戟科植物甘遂EuphorbiakansuiT.N.LiouexT.P.Wang的干燥块根^[1]，性寒，味苦，有毒，归肺、肾、大肠经，可泻水逐饮、消肿散结^[2]，临床多用于治疗肝硬化腹水、胸腔积液、水肿及二便不利等症。甘遂毒性较强，中医临床以醋制降低其毒性，缓解其药性，并以《内经》中“有故无殒”思想为指导加以应用。但目前对于甘遂的研究，多集中在化学成分及以正常动物为研究对象的毒性评价^[3-6]，未能较好地揭示中医有毒药物临床应用“有故无殒”指导思想的内涵，因而未能对醋甘遂的临床合理应用起到有效的支持作用。故本实验拟以正常和癌性腹水模型大鼠为研究对象，从肝、胃、肠组织形态和氧化损伤等方面探讨醋甘遂对正常及癌性腹水模型大鼠毒性的差异，以期为醋甘遂“有故无殒”的临床安全有效应用提供依据。

1材料

1.1试剂羧甲基纤维素钠（CMC-Na，上海久亿，批号20090910）;水合氯醛（Kermel，批号20080329）;氯化钠（NaCl，国药集团化学试剂有限公司，批号F20110422）;谷丙转氨酶（ALT，批号20131207）、谷草转氨酶（AST，批号20131207）、微量丙二醛（MDA，批号20131128）、微量还原型谷胱甘肽（GSH，批号20131206），以上试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2仪器FSH-Ⅱ型匀浆机（江苏金坛市环宇科学仪器厂）;TDZ4-WS台式低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）;全自动酶标仪（美国Bio-Red公司）;TP1020自动脱水机、RM2135型石蜡切片机、DM1000光学显微镜（均为德国LEICA公司）;CS-VI型摊片烤片机（湖北孝感宏业医用仪器有限公司）;Tissue-TekTEL组织包埋机（日本SAKURA公司）;隔水式电热恒温培养箱（上海市跃进医疗器械一厂）;微波炉（TCL有限公司）;MiniSee图像采集系统。

1.3药物及供试品的配制生甘遂药材购自陕西宝鸡县赤沙乡，经南京中医药大学唐于平教授鉴定为大戟科植物甘遂E.kansui的干燥块根。批号为20130914。醋甘遂：将所购生品依照2010年版《中国药典》（一部）醋炙法（附录ⅡD）加醋拌匀，闷透，待醋被吸尽后，将炒锅加热到260℃左右，不断翻炒，9min后至颜色加深，略有焦斑出锅，放凉。每100kg甘遂用醋30kg。打粉备用（得率为99.5%）。称取适量醋甘遂粉末（过4号筛），加0.5%CMC-Na制成质量浓度为8.5，17，34g·L-1的药液（均按生药量计算，中浓度对应剂量约为临床使用剂量的2倍）。

1.4动物雄性SD大鼠64只，SPF级，体重（230±20）g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证号SCXK（沪）2013-0016。

2方法

2.1分组大鼠按体重随机分为8组，每组8只，分别为空白组，模型组，正常醋甘遂低、中、高剂量组，模型醋甘遂低、中、高剂量组（简称正常低、中、高剂量组，模型低、中、高剂量组）。空白组、正常低、中、高剂量组各动物为正常动物，模型组、阳性药组、模型低、中、高剂量组各动物复制腹水模型。

2.2模型复制将冻存的Walker-256细胞株37℃复苏呈液态，1000r·min-1离心5min，沉淀用生理盐水悬浮至约含细胞个数1.2×108个/mL，每只大鼠注射1mL，进行传代，将传代后的腹水抽出进行细胞计数，用生理盐水稀释至细胞个数1×107个/mL，再给其余大鼠进行腹腔注射，每只注射1mL，复制癌性腹水模型。

2.3给药空白组、模型组给予0.5%CMC-Na灌胃，其余各组给予相应药液灌胃，给药体积10mL·kg-1，每日1次，连续7d。

2.4观察方法给药后观察大鼠精神状态，行为活动，饮食情况，二便情况，皮肤毛色，死亡情况，记录死亡时间。

2.5醋甘遂对大鼠肝功能指标的影响各组大鼠于第7天给药1h后麻醉，颈总动脉取血，静置30min后3500r·min-1离心10min，取上清液备用。取各组大鼠肝、胃、肠组织制成10%匀浆，3500r·min-1离心10min，取上清液备用。采用试剂盒方法进行血清和肝组织中AST，ALT活力的测定。

2.6醋甘遂对大鼠氧化损伤指标的影响取各组大鼠的10%肝匀浆、10%胃匀浆、10%肠匀浆及血清，按试剂盒方法测定肝、胃、肠组织及血清中MDA，GSH含量。

2.7醋甘遂对大鼠组织病理形态学的影响各组分别取一部分肝、胃、肠组织用4%中性多聚甲醛固定，常规HE染色，光镜下观察其组织形态学变化。

HE染色切片光镜下观察肝脏的组织形态^[6]。对肝组织形态进行病理分级、积分：肝组织结构正常，无明显变性、坏死及炎症细胞浸润，0分;肝小叶结构尚正常，可见明显的混浊肿胀、气球样变或脂肪变性，散在点状坏死（+）1分;肝小叶结构不清，可见明显的灶状坏死，伴有炎症细胞浸润（），2分;肝小叶结构不清、可见明显的片状坏死，伴有炎症细胞浸润（），3分;坏死细胞弥漫性存在于肝小叶中央，层次较多，伴有炎症细胞浸润（），4分。

HE染色切片显微镜下观察胃组织学改变^[5]。按黏膜层损伤深度及损伤占黏膜层的面积评分：损伤深度≤1/3的记1分，1/3<损伤深度<2/3的计2分，损伤深度≥2/3的计3分，1%≤损伤面积<30%的计1分，30%≤损伤面积<60%的计2分，60%≤损伤面积<90%的计3分，90%≤损伤面积的计4分;将损伤深度评分与损伤面积评分相乘，即得此小鼠胃黏膜损伤指数。

HE染色切片显微镜下观察小肠组织学改变^[5]。主要对小肠组织炎症轻重，病变深度，隐窝及上皮破坏情况进行评价。小肠黏膜损伤分为6度。0度为正常黏膜绒毛结构;1度为肠黏膜绒毛顶端上皮下间隙增宽;2度为绒毛上皮下间隙进一步扩大，绒毛尖端上皮抬高与固有膜分离;3度为绒毛两边上皮成块脱落;4度为绒毛上皮完全脱落，仅存固有膜结构;5度为肠黏膜固有膜崩解，出现出血和溃疡。

2.8数据分析实验数据采用SPSS19.0软件进行统计分析，各组定量检测数据以±s表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差（One-WayANOVA）分析，组间比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。数据方差不齐，不满足t检验条件时，采用Wilcoxon秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3结果

3.1醋甘遂对大鼠一般情况的影响实验中无大鼠死亡现象。空白组大鼠精神状态良好，行动灵活，毛发光泽，二便正常。各正常给药组大鼠精神状态尚好，体重减轻，可见不同程度的尿量增加，偶见稀便。模型组及各模型给药组大鼠毛色无光泽，眼神黯淡，精神萎靡，腹部胀大，严重者嘴唇青紫，肛周污秽，甚至尿血。

3.2醋甘遂对大鼠组织病理形态学的影响空白组大鼠肝组织结构正常，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝细胞索、肝血窦排列规则，肝小叶结构完整，未见肝细胞变性、坏死等病理变化。模型组大鼠肝组织结构镜下可见肝细胞呈气球样变，以环中央静脉分布的肝细胞灶性或片状坏死，伴炎性细胞浸润等病理改变。与空白组比较，正常不同剂量组肝组织有不同程度的气球样变，严重者出现坏死，且呈一定的剂量相关性。与模型组比较，模型不同剂量组大鼠肝细胞损伤均有一定程度的减轻，且呈一定的剂量相关性，实验结果见图1，表1。

空白组大鼠胃黏膜上皮结构完整，黏膜表面的胃小凹清晰可见，黏膜内的腺体排列紧密，固有腺体及黏膜层毛细血管无扩张淤血;模型组大鼠胃上皮细胞糜烂、脱落严重并伴有受腹水影响的炎症，与空白组比较，正常不同剂量胃上皮细胞有少量脱落、糜烂，且呈一定的剂量相关性。与模型组比较，模型不同剂量组大鼠胃上皮细胞损伤均有一定程度的减轻且呈一定的剂量相关性，实验结果见图2，表1。

空白组大鼠肠黏膜结构正常，模型组大鼠肠黏膜固有层可见大量中性粒细胞和上皮脱落严重，绒毛间隙增宽，灶性区域黏膜糜烂;与空白组比较，正常不同剂量组肠黏膜固有层绒毛脱落严重，有的甚至完全脱落，且呈一定的剂量相关性。与模型组比较，模型不同剂量组肠黏膜细胞均有一定程度的减轻，且呈一定的剂量相关性，实验结果见图3，表1。

3.3醋甘遂对大鼠肝功能指标的影响与空白组比较，模型组大鼠血清、肝脏中AST，ALT活力均显著增高（P<0.01），表明癌性腹水模型对大鼠肝脏有较显著损伤。与空白组相比，正常低、中、高剂量组大鼠血清中AST，ALT及肝脏中ALT活力均显著增高（P<0.05，P<0.01），且呈一定的量-效关系，正常高剂量组大鼠肝脏中AST活力显著增高（P<0.05），表明不同剂量醋甘遂均对正常大鼠肝脏有不同程度的损伤。与模型组比较，模型低、中、高剂量组大鼠血清中AST，ALT与模型中、高剂量组肝脏中AST及模型高剂量组肝脏中ALT活力均显著降低（P<0.05，P<0.01），且呈一定的量-毒关系。提示醋甘遂在正常大鼠上表现出肝损伤，但在癌性腹水模型大鼠上却表现出较好的保护作用，见表2。

3.4醋甘遂对大鼠氧化损伤指标的影响与空白组比较，模型组大鼠血清、肝、胃、肠组织中GSH含量均显著降低（P<0.01）。与空白组比较，正常低、中、高剂量组大鼠血清、胃组织与正常中、高剂量组大鼠肝、肠组织中GSH含量均显著降低（P<0.05，P<0.01），且呈一定的量-效关系。与模型组比较，模型高剂量组大鼠肠组织与模型中、高剂量组大鼠肝组织及模型低、中、高剂量组大鼠血清和胃组织中GSH含量明显升高，且呈一定的量-效关系。提示醋甘遂对正常大鼠表现出氧化损伤，但对模型大鼠表现出一定的保护作用，见表3。

与空白组比较，模型组大鼠血清，肝、胃、肠组织中MDA含量显著升高（P<0.01）。与空白组相比，正常低、中、高剂量组大鼠肝组织及正常中、高剂量组大鼠血清、胃、肠组织中MDA含量显著升高（P<0.01），且呈一定的量-毒关系。与模型组比较，模型高剂量组大鼠胃、肠组织与模型中、高剂量组大鼠肝组织及模型低、中、高剂量组大鼠血清中MDA含量显著降低（P<0.01），且呈一定的量-效关系。提示醋甘遂对正常大鼠表现出氧化损伤，但对模型大鼠表现出保护作用，见表4。

4讨论

甘遂峻下逐水作用峻猛，《本草从新》曰其为“下水之圣药”。但因毒性较强，限制了其临床应用。中医在研究有毒中药时以“有故无殒”为重要指导思想，《素问·六元正纪大论》云：“妇人重身，毒之何如……有故无殒，亦无殒也。”是指当药物作用于正常机体，毒性将作用于机体本身;而当机体有邪气，药物将作用于病邪，而表现出治疗作用^[7]，如砒霜用于治疗急性早幼粒细胞性白血病疗效显著^[8]。“有故无殒”思想中所蕴含的辨证用药减毒的理念，实质是研究特定药物与特定证候或机体状态之间的对应关系及其内在的变化规律^[9]。然而，甘遂的现代研究较多关注了其物质基础及作用机制对毒-效关系的影响，而忽略了药物对不同状态的机体产生的毒性差异。

甘遂善泻水逐饮、消肿散结，对水肿胀满、胸腹积水等证均有良好的治疗与改善作用。故本实验选用腹水模型，来研究醋甘遂对正常与病理状态下动物的毒性差异。目前可用于腹水研究的模型主要有肝硬化腹水模型、癌性腹水模型、胰腺炎相关腹水模型、腹膜炎相关腹水模型等。肝硬化腹水模型常采用四氯化碳（CCl4）法，然而CCl4肝毒性较强，低剂量使用时建模周期长，为缩短建模过程而提高使用剂量又会造成肝细胞损伤剧烈，致死率较高，因而成模率低，稳定性差^[10]。腹膜炎腹水模型产生的腹水量较少，不适用于利水药物的评价，而胰腺炎相关腹水模型常以胰腺炎腹水致其他脏器的损伤为研究重点^[11]。癌性腹水模型符合中医“痰饮”范畴，可模拟临床肿瘤腹水患者，且有文献报道^[12]，癌性腹水模型成模周期短，大鼠腹腔注射癌性腹水4～5d即有腹水生成，—次腹水传代成模率可达到60%，二次传代成模率可达80%。故本实验选用相对造模周期短、成模率高、存活率高、稳定性强的癌性腹水模型进行试验。本模型造模时需要注意的是，癌性腹水多次连续传代时会导致细胞活性增强，大鼠存活时间短且死亡率高，因此建议传代不宜超过2次以上。

甘遂具有明确的肝^[6]、胃肠道^[5]毒性，其机制可能为细胞膜的氧化损伤。甘遂对体内肝、胃、肠组织细胞产生刺激，破坏细胞膜的完整性，致使细胞膜通透性增加^[13]，ALT，AST相继释放入血液，激起炎症反应，使产生炎性细胞和活性氧基团，导致体内清除自由基的酶系（如GSH-Px/GSH-Re）活性降低，造成自由基堆积，产生过氧化脂质，增加自由基毒性作用，激起连锁增殖反应，形成一系列脂质自由基及其降解产物MDA^[14]。最终氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤^[15]，促使细胞凋亡。

本实验中，从大鼠给药后的状况、血液组织生化指标及病理改变可看出，正常生理状态下与病理状态下的大鼠给药后表现出的毒性结果差异明显，正常大鼠给药后，随着剂量的增加，肝损伤和氧化损伤指标呈升高趋势，组织病理切片显示高剂量组大鼠肝、胃、肠细胞损伤严重并伴有不同程度的炎性反应。而模型组给药后，中、高剂量组显示肝损伤和氧化损伤较模型组均有所降低，病理损伤也有一定程度的减轻，表明醋甘遂对癌性腹水模型大鼠具有一定的保护作用。上述研究提示，醋甘遂“有故无殒”的作用机制可能与降低机体炎症反应和提高机体抗氧化能力有关。其途径可能是：①降低由于细胞膜通透性增加而溢出进入血液的酶类如ALT，AST含量，减轻炎症反应;②提高血液及组织内GSH还原酶系统活性，减轻自由基的堆积，缓解脂质过氧化;③降低血液及组织内MDA含量，提高线粒体氧化磷酸化功能，减少O2-的渗漏，从而减少自由基的生成。

综上所述，醋甘遂对于病理状态有比正常生理状态下较低的毒性，在一定剂量范围内表现为“有故无殒”，其安全运用于临床治疗的前提之一是“对症”，印证了辨证用药减毒的科学性^[16]。后续将在本实验的基础上，研究醋甘遂在生理与病理状态下效-毒-代谢-代谢组学等各方面的差异及特点，以期揭示醋甘遂“有故无殒”的内在本质，为醋甘遂临床安全有效应用提供依据，为有毒中药科学应用基础研究提供思路与方法。

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[责任编辑张宁宁]