摘要：【目的】掌握三黄鸡线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）基因的生物信息学，为MAVS基因誘导表达及禽类固有免疫相关机制研究打下基础。【方法】根据GenBank中已公布的原鸡MAVS基因序列设计1对特异性引物，采用RT-PCR扩增三黄鸡MAVS基因，并应用相关生物软件进行序列分析及其蛋白结构预测。【结果】三黄鸡MAVS基因编码区（CDS）全长1926 bp，编码641个氨基酸，与GenBank中已发表的原鸡MAVS氨基酸序列（NP_001012911.1）比对，三黄鸡MAVS氨基酸序列在第440、488、506和606位存在4个氨基酸差异，分别为440A→T、488P→L、506I→L和606E→K。三黄鸡MAVS基因与原鸡的相似性最高，达99.0%；与日本鹌鹑的相似性次之，为91.0%；与斑马鱼的相似性最低，仅37.6%。三黄鸡MAVS蛋白分子质量为67.79 ku，理论等电点（pI）为5.04，属于跨膜蛋白，无信号肽序列；其二级结构中折叠占0.5%，无规则卷曲占88.7%，螺旋占10.8%。【结论】三黄鸡MAVS基因序列表现出高度的保守性，可作为今后研究三黄鸡抗病毒机制的重要指标之一。
关键词： 三黄鸡；MAVS基因；克隆；生物信息学；相似性
中图分类号： S831.89 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）07-1216-06
0 引言
【研究意义】线粒体抗病毒信号蛋白（Mitochondrial anti-viral signaling protein，MAVS）是一种在宿主固有免疫信号通路中扮演重要角色的接头蛋白（Seth et al.，2005）。当宿主受RNA病毒感染，RNA解螺旋酶（RIG-I和MDA5）识别病毒衍生RNA配体后发生构象改变（Kowalinski et al.，2011），N端Caspase招募结构域（Amino-terminalcaspase recruitment domain，CARD）暴露出来，RIG-I/MDA5转移至线粒体外膜，并与MAVS的CARD相互作用，进而刺激下游的TBK1和IKK复合体分别活化NF-κB和IRF3固有免疫相关信号通路，诱导干扰素表达，最终参与抗病毒反应（杨星星等，2013）。因此，研究MAVS基因的生物信息学对其诱导表达及多克隆抗体的制备具有重要指导意义。【前人研究进展】MAVS也称为IPS-1（IFN-β promoter stimulator）（Kawai et al.，2005）、Cardif（CARD adaptor inducing IFN-β）（Meylan et al.，2005）或VISA（Virus- induced signaling protein）（Xu et al.，2005），是2005年在RIG-I/MDA5下游发现的一个适配器分子。贾永侠等（2008）构建了人类MAVS的小干扰RNA真核表达质粒，并筛选出稳定干扰MAVS的细胞株。朱方俊（2010）通过探究线粒体MAVS基因在马立克氏病毒感染应答过程中的差异表达情况，证实MAVS基因表达在抗马立克氏病毒过程中发挥重要作用，印证了MAVS基因参与抗病毒通路并发挥重要作用的假说。管楷（2011）研究发现，MAVS通过与VDAC1直接相互作用而增强后者稳定性，提高其表达水平，进而诱导细胞凋亡。宋婷（2012）研究发现，MAVS通过肿瘤坏死因子受体作用因子3（TRAF3）上调ASC的蛋白稳定性，促进其介导的IL-1产生。周维（2015）研究表明，青鱼MAVS是一种线粒体蛋白，在鳃、肾脏、心脏、肠、肝脏、肌肉、皮肤和脾脏等组织中均呈稳定表达，在受病毒侵染后则作为病毒感应器RIG-1的适配器发挥作用。此外，MAVS敲除小鼠试验（Kumar et al.，2006；Sun et al.，2006）与半胱天冬酶降解MAVS试验（Yu et al.，2010）均表明缺失MAVS会影响I型干扰素和炎性细胞因子的产生。可见，MAVS在抗病毒固有免疫中发挥重要作用。【本研究切入点】广西是三黄鸡养殖规模较大的地区之一，近年来因禽流感、新城疫等重大疫病的威胁，其产业发展面临巨大挑战（韦平等，2013），因此，在做好疫病防控工作的同时要加强禽类固有免疫相关机制的研究，促进其产业健康发展。【拟解决的关键问题】对三黄鸡MAVS基因编码区（CDS）进行克隆，分析三黄鸡MAVS基因的遗传变异情况，并预测其编码氨基酸序列的亲/疏水性、二级结构、跨膜区与信号肽，以期为三黄鸡MAVS基因的诱导表达及禽类固有免疫相关机制研究打下基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
三黄鸡由广西富凤农牧有限公司提供。PrimeSTAR Max Premix（2×）、限制性内切酶EcoR I与Xho I、逆转录试剂盒和pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1. 2 引物设计与合成
参照NCBI上的原鸡MAVS基因序列（NM_0010 12893.1），利用Primer 6.0和Oligo 7设计1对特异性引物。上游引物（F）：5"-TTGGAATTCATGGGTTTCGCC GAGGACAAAGTGTAT-3"（下划线部分为EcoR I酶切位点）；下游引物（R）：5"-CCGCTCGAGTCTATTTCTG
CAATCGTGTGTACACCAG-3"（下划线部分为Xho I酶切位点）。引物由广州华大基因有限公司合成。
1. 3 总RNA提取与反转录
采集新鲜抗凝血样5 mL，以外周血淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞后，参照总RNA抽提试剂盒说明提取外周血淋巴细胞总RNA，并按反转录试剂盒操作说明进行反转录。
1. 4 PCR扩增
PCR反应体系：PrimeSTAR Max Premix（2×）25.0 μL，上、下游引物（25 pmol/L）各1.0 μL，模板cDNA 2.0 μL，纯化水21.0 μL。扩增程序：98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，进行35个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，并回收纯化目的条带。
1. 5 重组质粒构建与鉴定
将纯化目的片段连接至pMD18-T载体，再转化E. coli DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选挑取明显白色单菌落，接种于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中（1 mL），增菌培养后，提取重组质粒进行双酶切鉴定和PCR鉴定。选取3个阳性样品送至广州华大基因有限公司测序。
1. 6 三黄鸡MAVS基因序列分析及其蛋白结构预测
以在线Expasy软件（http：//web.expasy.org/protpa）对三黄鸡MAVS基因进行基本理化性质预测；以MegAlign软件分析三黄鸡MAVS基因序列的遗传演化关系；以ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）在线软件进行三黄鸡MAVS蛋白亲/疏水性预测，同时分别应用蛋白质结构预测服务器PSIPRED（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）、TMHMM Server 2.0（http：//www.cbs. dtu.dk/services/TM-HMM/）和SignalP 4.1 Server软件（http：//www.cbs.dtu. Dk/servces/SignalP/）对其二级结构、跨膜区和信号肽进行分析。
2 结果与分析
2. 1 RT-PCR扩增结果
以三黄鸡外周血淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，结果表明，三黄鸡MAVS基因CDS全长约2000 bp，与预期结果一致（图1）。
2. 2 重组质粒的鉴定结果
抽提重组质粒进行EcoR I与Xho I双酶切鉴定，结果获得两条片段，一条为2692 bp的克隆载体片段，另一条为1926 bp的目的片段，与预期结果相符；重组质粒的PCR鉴定结果亦显示，可获得一条1926 bp的目的片段，与预期结果一致（图2）。表明三黄鸡MAVS基因重组质粒构建成功。
2. 3 三黄鸡MAVS基因序列的测定分析结果
三黄鸡MAVS基因CDS全长1926 bp，编码641个氨基酸。与原鸡MAVS基因序列（NM_001012893.1）的核苷酸相似性高达99.0%。用DNAMAN软件将三黄鸡MAVS氨基酸序列与GenBank中已发表的原鸡MAVS氨基酸序列（NP_001012911.1）进行比对，结果发现在第440、488、506和606位存在4个氨基酸差异，分别为
440A→T、488P→L、506I→L和606E→K（图3）。
2. 4 三黄鸡MAVS基因序列的同源性及遗传演化关系分析结果
将克隆获得的三黄鸡MAVS基因与GenBank中已公布的9个其他物种MAVS基因序列进行核苷酸相似性比对分析，结果显示，三黄鸡MAVS基因与原鸡的相似性最高，达99.0%；与日本鹌鹑的相似性次之，为91.0%；与斑马鱼的相似性最低，仅37.6%。基于MAVS基因序列构建系统发育进化树，结果发现，三黄鸡与日本鹌鹑、火鸡、绿头鸭等禽类汇聚成一个分支，其中与日本鹌鹑的亲缘关系最近；哺乳动物形成一个与三黄鸡遗传距离较近的分支；而斑马鱼与三黄鸡的遗传距离最远（图4）。
2. 5 三黄鸡MAVS基因理化性质的分析结果
通过Expasy在线软件对三黄鸡MAVS基因进行理化性质分析，结果显示，该基因编码641个氨基酸，相对分子质量为67.79 ku，推導的理论等电点（pI）为5.04；对应蛋白的分子式为C2930H4586N838O977S19，原子个数为9350；氨基酸组成中，正电荷氨基酸残基总数78个，负电荷氨基酸残基总数48个；蛋白不稳定系数为57.96，提示该蛋白可能为不稳定蛋白；脂溶性指数为65.34，总平均亲水性值（GRAVY）为-0.548，即具有较好的亲水性。
2. 6 三黄鸡MAVS蛋白亲/疏水性预测结果
利用ProtScale预测三黄鸡MAVS蛋白的亲/疏水性，结果显示，三黄鸡MAVS蛋白在630处附近氨基酸残基疏水性较强，峰值约为3.2，在280处附近氨基酸残基的亲水性最强，峰值约为3.1（图5）。
2. 7 三黄鸡MAVS蛋白跨膜区、二级结构及信号肽预测结果
应用TMHMM Server 2.0对三黄鸡MAVS氨基酸序列进行跨膜区分析，结果显示，该蛋白由胞外区（1～616位氨基酸）、跨膜区（617～636位氨基酸）和胞内区（637～641位氨基酸）3部分组成，表明三黄鸡MAVS蛋白绝大部分位于胞内区，且仅有一个跨膜结构域（图6）。将推测的三黄鸡MAVS氨基酸序列输入到蛋白质结构预测服务器PSIPRED中，对其二级结构进行预测，结果显示，MAVS肽链中折叠占0.5%，无规则卷曲占88.7%，螺旋占10.8%，其中无规则卷曲在肽链中间部位占据绝大部分位置，螺旋主要出现在肽链两端且N端相对较多，折叠仅在N端出现一处（图7）。用SignalP 4.1 Server软件预测其信号肽，结果发现三黄鸡MAVS蛋白无信号肽（图8）。
3 讨论
广西三黄鸡饲养历史悠久，在自然选择和长期驯化中，已成为极具特色的优质三黄鸡品种。广西玉林三黄鸡饲养量最多，是我国最大的三黄鸡养殖基地，但各种疾病的威胁给其养殖业造成重大损失（戴腾飞和周贞兵，2010）。MAVS蛋白与固有免疫机制密切相关，已受到许多学者的关注，但目前关于三黄鸡MAVS基因的研究鲜见报道。为此，本研究首次对三黄鸡MAVS基因遗传变异情况及其蛋白理化性质、二级结构、亲/疏水性和信号肽进行预测分析，以期为下一步研究MAVS基因诱导表达与三黄鸡的免疫相关机制打下基础。
宿主细胞依赖固有免疫系统识别入侵的病原微生物，经相关细胞信号转导通路，激活干扰素和炎性细胞因子的表达，进而清除入侵的病原微生物（孟春花等，2016）。在固有免疫应答途径中，MAVS是调节I型干扰素产生的关键因子。在先天免疫相关的蛋白质中，MAVS是第一个被发现定位在线粒体上，意味着线粒体参与了抗病毒的固有免疫应答（Scott，2010）。MAVS在固有免疫反应中发挥枢纽作用，是RIG-I信号通路中的唯一接头分子，通过与RIG-I的CARD结构域结合后，可激活NF-κB和IRF-3通路，进一步激活干扰素的表达（Sun et al.，2006）。本研究结果表明，三黄鸡MAVS蛋白无信号肽，不是分泌蛋白，即信号肽与蛋白的细胞内定位有关。MAVS定位在线粒体外膜和过氧化物酶体上，在细胞内的不同定位决定其在抗病毒固有免疫中的不同调节机制。只有在过氧化物酶体和线粒体上同时定位，MAVS才可诱导干扰素刺激基因快速且稳定表达（Seth et al.，2005；杨星星等，2013）。本研究应用TMHMM Server 2.0对三黄鸡MAVS氨基酸序列进行跨膜区分析，结果发现三黄鸡MAVS为一次跨膜蛋白，跨膜区位于肽链C端，与哺乳动物的MAVS相似（Seth et al.，2005），也暗示禽类和哺乳动物的MAVS具有较高的保守性。MAVS可通过模式识别受体（Pattern recognition receptor，PRR）调节TLR信号通路，主要是TLR3通路（Xu et al.，2005）。干扰素基因刺激蛋白（Stimulator of interferon genes，STING）能与MAVS相互作用，从而激活NF-κB和IRF-3通路（Ishikawa and Barber，2008）。TLR3與STING是TLR信号通路和RIG-1信号通路的重要分子，MAVS能与二者相互作用，说明其在机体固有免疫信号通路中扮演着关键角色。
4 结论
三黄鸡MAVS基因CDS全长1926 bp，编码641个氨基酸，与原鸡的亲缘关系最近，相似性达99.0%，与日本鹌鹑的相似性次之，达91.0%。可见，三黄鸡MAVS基因序列表现出高度的保守性，可作为今后研究三黄鸡抗病毒机制的重要指标之一。
参考文献：
戴腾飞，周贞兵. 2010. 微生态制剂在广西三黄鸡养殖中的应用及推广[J]. 广西农业科学，41（5）： 499-501.
Dai T F，Zhou Z B. 2010. Application of microecologics on Sanhuang chicken farms in Guangxi[J]. Guangxi Agricultural Sciences，41（5）：499-501.
管楷. 2011. MAVS通过VDAC1诱导细胞凋亡的分子机制研究[D]. 合肥：安徽大学.
Guan K. 2011. A study on molecular mechanism of MAVS induced cell apoptosis though VDAC1[D]. Hefei：Anhui University.
贾永侠，赵帆，马红芳，李力，黄蓓，郑子瑞，宋婷，魏从文，何湘，张艳红，钟辉. 2008. 人MAVS小干扰RNA质粒的构建及稳定干扰 MAVS 细胞株的筛选[J]. 军事医学科学院院刊，32（6）：504-507.
Jia Y X，Zhao F，Ma H F，Li L，Huang B，Zheng Z R，Song T，Wei C W，He X，Zhang Y H，Zhong H. 2008. Construeiton of a small interference RNA expression vector and scree-
ning stable knockdown cell lines of human MAVS[J]. Bulletin of the Academy of Military Medical Sciences，32（6）：504-507.
孟春花，王春玲，李静心，李隐侠，朱前明，曹少先. 2016. 猪APOBEC3F基因真核表达载体的构建及其在MARC145细胞中的表达定位[J]. 江苏农业学报，31（6）：1344-1349.
Meng C H，Wang C L，Li J X，Li Y X，Zhu Q M，Cao S X. 2016. Construction of eukaryotic vector for porcine APOBEC3F gene and its expression and localization in MARC145 cells[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，31（6）：1344-1349.
宋婷. 2012. MAVS通过TRAF3调控ASC介导的炎症信号通路的研究[D]. 北京：中国人民解放军军事医学科学院.
Song T. 2012. MAVS regulates ASC-mediated inflammatory signaling pathway via TRAF3[D]. Beijing：Academy of Military Medical Sciences， the Chinese People’s Liberation Army.
韦平，梁远东，韦凤英. 2013. 广西家禽业生产现状及我国家禽业发展前景探讨[J]. 中国家禽，35（23）：2-6.
Wei P，Liang Y D，Wei F Y. 2013. Production status of Guangxi poultry industry and the development prospect of China poultry industry[J]. China Poultry，35（23）：2-6.
杨星星，王凯，陈晓娟，邢雅玲，陈忠斌. 2013. 线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）在宿主天然免疫信号通路中的调节作用[J]. 生物化学与生物物理学进展，40（5）：397-405.
Yang X X，Wang K，Chen X J，Xing Y L，Chen Z B. 2013. Functions and regulation of MAVS，the mitochondrial antiviral signaling protein in innate immunity[J]. Progress in Biochemistry and Biophysics，40（5）：397-405.
周维. 2015. 青鱼MAVS的克隆及功能初探[D]. 长沙：湖南师范大学.
Zhou W. 2015. Molecular cloning and a preliminary study on the function of MAVS from black carp[D]. Hunan：Hunan Normal University.
朱方俊. 2010. 线粒体MAVS基因在马立克氏病毒感染应答过程中的差异表达研究[D]. 雅安：四川农业大学.
Zhu F J. 2010. The difference of expression of MAVS gene in response to Marek’s virus infection[D]. Ya’an：Sichuan Agricultural University.
Ishikawa H，Barber G N. 2008. STING is an endoplasmic reticulum adaptor that facilitates innate immune signaling[J]. Nature，455（7213）： 674-678.
Kawai T，Takahashi K，Sato S，Coban C，Kumar H，Kato H，Ishii K J，Takeuchi O，Akira S. 2005. IPS-1， an adaptor triggering RIG-I-and Mda5-mediated type I interferon induction[J]. Nature Immunology，6（10）：981-988.
Kowalinski E，Lunardi T，McCarthy A A，Louber J，Brunel J，Grigorov B，Gerlier D，Cusack S. 2011. Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA[J]. Cell，147（2）：423-435.
Kumar H，Kawai T，Kato H，Sato S，Takahashi K，Coban C，Yamamoto M，Uematsu S，Ishii K J，University O，Akira S. 2006. Essential role of IPS-1 in innate immune responses against RNA viruses[J]. Journal of Experimental Medicine，203（7）：1795-1803.
Meylan E，Curran J，Hofmann K，Moradpour D，Binder M，Bartens-
chlager R，Tschopp J. 2005. Cardif is an adaptor protein in the RIG-I antiviral pathway and is targeted by hepatitis C virus[J]. Nature，437（7062）：1167-1172.
Scott I. 2010. The role of mitochondria in the mammalian antiviral defense system[J]. Mitochondrion，10（4）：316-320.
Seth R B，Sun L，Ea C K，Chen Z J. 2005. Identification and characterization of MAVS，a mitochondrial antiviral signa-
ling protein that activates NF-κB and IRF 3[J]. Cell，122（5）：669-682.
Sun Q，Sun L，Liu H H，Chen X，Seth R B，Forman J，Chen Z J. 2006. The specific and essential role of MAVS in antiviral innate immune responses[J]. Immunity，24（5）：633-642.
Xu L G，Wang Y Y，Han K J，Li L Y，Zhai Z，Shu H B. 2005. VISA is an adapter protein required for virus-triggered IFN-beta signaling[J]. Molecular Cell，19（6）：727-740.
Yu C Y，Chiang R L，Chang T H，Liao C L，Lin Y L. 2010. The interferon stimulator mitochondrial antiviral signaling protein facilitates cell death by disrupting the mitochondrial membrane potential and by activating caspases[J]. Journal of Virology，84（5）：2421-2431.
（責任编辑 兰宗宝）