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[摘要] 目的 研究温州地区急性白血病与RAD50基因多态性的关系。 方法 选取2018年6月～2019年6月来我院血液科就诊治疗的温州地区急性白血病100例患者为研究对象，并将其纳入急性白血病组（n=100）。100名体检正常者为对照组。采用PCR技术确定两组RAD50第4号内含子（rs17166050）基因分型（GA型、GG型），比较健康对照组与急性白血病组基因型频率。 结果 健康对照组与急性白血病组的RAD50（rs17166050）基因型GA型和GG型出现的频率比较差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 温州地区急性白血病与RAD50第4号内含子（rs17166050）的G等位基因的易感性相關。
[关键词] RAD50;PCR;急性白血病;多态性
[中图分类号] R733.71 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2019）29-0029-03
Study on the gene polymorphism of RAD50 in acute leukemia
WU Xiaole XIE Haixiao WU Changchun HU Wangqiang CHEN Jian
The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China
[Abstract] Objective To study the relationship between acute leukemia and RAD50 gene polymorphism in Wenzhou area. Methods 100 patients with acute leukemia in Wenzhou area who were diagnosed and treated in the department of hematology in our hospital from June 2018 to June 2019 were selected as the study subjects， and they were included in the acute leukemia group（n=100）， 100 normal patients receiving physical examinations were included in the control group. The genotypes （GA type， GG type） of RAD50 intron 4 （rs17166050） was determined by PCR. The genotype frequencies were compared between the healthy control group and the acute leukemia group. Results The differences in the frequencies of RAD50（rs17166050） genotypes GA and GG between the healthy control group and the acute leukemia group were statistically significant（P<0.05）. Conclusion Acute leukemia in Wenzhou area is associated with susceptibility to the G allele of RAD50 intron 4（rs17166050）.
[Key words] RAD50; PCR; Acute leukemia; Polymorphism
急性白血病俗称“血癌”，患者骨髓中大量的原始细胞增殖分化蓄积，并广泛浸润人体各器官。急性白血病的发生有多方面的因素，相关研究[1]表明急性白血病的遗传因素与肿瘤的发生有密切关系，遗传因素中基因组的不稳定性起重要作用。Mosor M等[2]发现RAD50基因中部分基因变异与儿童急性白血病的易感性相关。李雯等[3]亦研究表明RAD50的基因多态性可能会增加我国中部地区儿童急性淋巴细胞白血病的患病率。RAD50基因多态性和急性白血病的关系鲜见报道。本文以温州地区100例急性白血病患者为研究对象，探讨急性白血病与RAD50第4号内含子rs17166050（单核苷酸多态性数据库编号为17166050）基因多态性的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2018年6月～2019年6月来我院血液科就诊治疗的浙江温州地区急性白血病初诊100例患者为研究对象，入选标准是经骨髓穿刺确诊为急性白血病患者。急性白血病组中，男53例，女47例，年龄19～55岁。100例急性白血病患者中有29例急性淋巴细胞白血病（ALL），8例急性粒细胞白血病未分化型（M1），11例急性白血病部分分化型（M2），33例急性早幼粒细胞白血病（M3），19例急性单核细胞白血病（M5）。100例体检正常者为对照。对照组纳入标准：一般体格检查及血常规肝肾功能等各项检查正常。对照组中，男51例，女49例，年龄22～58岁。两组所在地均为浙江温州或其周边地区。两组构成基本资料无明显差异（P>0.05）。该项实验通过温州医科大学附属第一医院伦理委员会审批，所有参与人员均签署知情同意书。
1.2 RAD rs17166050基因的多态性分析
急性白血病组治疗前和对照组分别于早晨8点采集患者肘部静脉血2 mL，采用乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）抗凝剂抗凝，充分颠倒混匀。全血标本冻存于-40℃冰箱。DNA提取试剂盒来自北京天根生物有限公司，操作严格按照说明书进行。引物设计分别为：正向5’-CGAG AAAT GATC AGTT CTCT TGG-3’，反向5’-GTTC AATA ACTT AATG GACT ACAA AGT-3’，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR总反应量为25 μL，包括PCR Buffer，MgCl2，dNTP，Taq DNA聚合酶和引物。反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃30 s退火，72℃30 s延伸，30个循环。PCR反应扩增目的产物长度为186 bp。PCR产物5 μL在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，用Goldview标记PCR产物大小，待电泳出目的条带，割胶提取纯化，在全自动测序仪上进行测序（美国Applera公司，ABI 3730XL型）。
1.3 统计学分析
采用SPSS 16.0统计学软件进行分析。计数资料以百分率（%）表示，采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
100例急性白血病组RAD50基因（rs17166050）GA型占38%，GG型占62%;100例健康对照组RAD50基因（rs17166050）GA型占55%，GG型占45%。急性白血病组的RAD50基因（rs17166050）的GA、GG基因频率与健康对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），急性白血病组G基因的分布明显高出健康对照组，见表1。RAD50基因（rs17166050）GA型、GG型测序图见封三图1～2。两组均未检到野生AA型。
3讨论
急性白血病是威胁人类健康与生存的恶性肿瘤，若不经特殊治疗，平均生存期仅3个月左右，甚至在诊断后数天死亡。急性白血病的致病发病原因尚不十分明确，有多种因素，如染色体的异常，包括染色体易位、基因突变等，还包括放射损伤、化学药物中毒或有毒物质的侵犯，如苯中毒[4，5]。急性白血病在我国常见恶性肿瘤的排名处于第6位至第8位，并且发病呈年轻化趋势[6，7]，但随着我国医学诊断和治疗水平的提高，部分急性白血病患者病情获得缓解，可以长期存活，但总体治愈率仍较低。在人类生命过程中，生物体的DNA不断受到内源性因素（如遗传因素）和外源性因素（如放射、化学药物的攻击），内外攻击可能会损伤染色体DNA。DNA损伤中最严重的是DNA双链断裂（DNA double-strand break，DSB）[8，9]，DSB会导致细胞死亡、基因组不稳定、染色体畸形，若不能及时修复，可能会引发癌症[10]。识别、修复DNA的损伤即为DNA损伤应答（DNA damage response，DDR）。DDR是复杂的蛋白网络系统，对维护基因组完整和保证生物遗传性状稳定具有非常重要的意义[11-13]。DDR可分为两大系统，即DNA损伤监控系统（DNA-damage check point system）和DNA修复系统（DNA-repair system）。DNA双链断裂时细胞可启动DNA修复系统，人类细胞DSB的修复有两条路径，分别为同源重组修复（homologous recombination repair，HR）和非同源末端接合（non-homologous end-joining，NHEJ）。当细胞内存在与损伤DNA同源的DNA片段时，启动同源重组机制。若细胞内没有可以同源替代的DNA片段时则启用非同源末端接合，该修复机制不需要任何模板的帮助，其修复蛋白可以直接将双股断裂的DNA末端拉近，并在DNA连接酶的作用下，将断裂的两股DNA重新接合。同源重组修復和非同源末端接合这两种修复机制的初始阶段都需要DNA损伤信号的识别。MRN复合体能够最先识别DNA双链断裂并向机体发出相应信号[14]，MRN复合体是DNA修复系统的重要组成部分，是由MREll、RAD50、NBSl构成的高度保守的蛋白体。DNA双链断裂损伤修复是一个不可逆的过程，中间牵涉的各个反应环节和产物极其复杂，MRN复合体在DNA修复系统中的关键作用是当前生物医学界的研究热点。
本研究的RAD50是参与构成MRN复合体的一个亚单位。RAD50基因在人类第5号染色体长臂3区1带，含有87698个碱基，分子量为153000。RAD50结构包含ATP结合位点，N氮端的Walker A、C碳端的Walker B，卷曲螺旋结构（coiled coils）和锌钩结构（Zn hook）。RAD50的ATP结合位点直接影响细胞对DNA损伤的敏感性[15]，另外，其锌钩结构中含有一段半胱氨酸序列，该序列高度保守，序列折叠后可连接两个不同的MRN复合体至DNA双链断裂位点[16，17]，有利于修复DNA。RAD50可以稳定染色体结构，并可修复蛋白，其蛋白结构特殊，细胞损伤修复网络复杂，RAD50对参与DNA修复下游蛋白有重要影响[18]。
近年来，RAD50基因与肿瘤的关系引起学者们的关注。有波兰学者研究了220例儿童急性白血病患者，发现RAD50_rs17166050不同的等位基因与儿童急性白血病易感性有关，且p.1171V突变是儿童实体瘤的风险因子[2]。Fan C等[19]研究了7657例乳腺癌患者，有26例患者（占比0.34%）发现RAD50致病突变，其中16例患者（占比0.21%）发现三种常见突变（L719fs、K994fs、H1269fs），但这三种常见突变在5000例正常对照组的检出率也有0.18%，结论是RAD50突变并不明显增加乳腺癌患病风险，但乳腺癌患者中有RAD50突变的患者比没有RAD50突变的患者的生存率和预后更差。恶性肿瘤细胞在患者体内增殖旺盛，提高肿瘤治疗疗效的关键是抑制肿瘤细胞的快速生长。严睿成等[20]研究了突变型RAD50蛋白因其可干扰细胞的DNA双链断裂修复，可加强放射治疗对鼻咽癌肿瘤细胞的抑制作用。国外学者实验结果与严睿成结论一致：MRN（MREll、RAD50、NBSl）复合体功能结构的破坏可加强放射治疗对恶性肿瘤细胞的杀伤力[21]。
本研究表1可见，温州地区100例急性白血病患者中，RAD50_rs17166050（单核苷酸多态性数据库编号为17166050）基因多态性GA型占38%，GG型占62%;而健康对照组GA型占55%，GG型占45%，急性白血病患者含有GG 基因的频率比健康体检组高，有显著性差异（P<0.05），G等位基因可能会干扰RAD50蛋白功能，可能为急性白血病的易感因素。有学者认为该等位基因位于RAD50的第4内含子，推测其会影响RNA基因转录的剪接过程，另外有学者表示，RAD50的G等位基因会干扰RAD50基因的表达[22]。近年来，基因测序的临床应用使血液肿瘤的诊治趋于精准化，深入研究MRN（MREll、RAD50、NBSl）在肿瘤发生过程中的普遍性作用规律将会为未来肿瘤治疗带来新的治疗靶点与策略[23，24]。
綜上所述，本文对温州地区100例急性白血病患者进行RAD50的第4号内含子rs17166050（单核苷酸多态性数据库编号为17166050）G>A多态性分析，推测其G等位基因是急性白血病的易感因素，GG基因型为风险因子。本研究取得一定成效，但因样本量偏小，可能导致研究结论存在片面性，后续还有待收集更多样本，进行深入研究。
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（收稿日期：2019-04-23）