摘要：通过原核表达系统表达了猪链球菌2型（Streptococcus suis type2，SS2）1910RR蛋白，并制备了多克隆抗体。结果表明，猪链球菌2型1910RR重组蛋白以上清形式表达，Western-blot检测证实了1910RR蛋白具有良好的免疫学活性，1910RR多克隆抗体效价为1∶4，为进一步研究1910RR蛋白功能奠定了良好基础。
关键词：猪链球菌2型（Streptococcus suis type2，SS2）；1910RR蛋白； 原核表达；多克隆抗体
中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）24-6320-04
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.058
Abstract： The polyclonal antibody of 1910RR protein of Streptococcus suis type 2 was expressed and prepared. The results showed that 1910RR protein was expressed in the supernatant and has good immunological activity. The polyclonal antibodies of rabbit anti 1910RR protein was 1∶4. The preparation of polyclonal antibody was successful and can be used for function research of 1910RR protein.
Key words：Streptococcus suis type 2；1910RR protein；prokaryotic expression； polyclonal antibody
猪链球菌2型（Streptococcus suis type2，SS2）是一种重要的人畜共患病原菌，可引起猪的急性败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎、肺炎等疾病，并可引起人类脑膜炎、败血症等，严重者导致死亡[1，2]。1998年和2005年，江苏省和四川省人流行感染SS2事件，患者出现中毒性休克综合征[3]，引起了国内外学者对SS2的广泛关注与研究。
SS2毒力因子种类很多，如荚膜多糖（Capsular polysaccha-ride，CPS）、溶菌酶释放蛋白（Muramidase-released protein，MRP）、胞外因子（Extracellular factor，EF）、溶血素（Suilysin，Sly）等[4，5]。由于不同菌株所具有的毒力因子各不相同，同一种毒力因子在不同菌株中的作用也不一定相同，同时单独研究毒力因子的功能并不能深入解释SS2的致病机制，因此研究这些毒力因子在SS2致病过程中是如何受调控并共同发挥作用将更为重要[6，7]，广泛存在于细菌中的二元调控系统（Two-component signal transduction system，TCSTS）作为调节自身功能和毒力的中枢系统而成为研究热点。
经典的TCS由两部分组成，组氨酸激酶（Histidine kinase，HK）和反应调控因子（Response regulator，RR）。经典的信号通路包括外界信号输入、HK自体磷酸化、RR磷酸化及信号输出[8]。1910HK/RR是猪链球菌2型的一对双组分调控系统，1910HK接受并传递外界信号刺激，反应调控因子1910RR则负责调控下游目标基因的表达或使目标蛋白的功能发生变换。本试验克隆了猪链球菌2型1910rr基因，连接到原核表达载体pET-30a中，通过表达条件的摸索，成功获得分泌性表达蛋白，制备了兔抗1910RR蛋白的多克隆抗体，为进一步研究1910RR蛋白功能奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
原核表达质粒pET-30a由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所兽医室实验室保存。Taq DNA聚合酶、限制性内切酶BamHⅠ/Hind Ⅲ及T4 DNA连接酶、E.coli DH5α、BL21（DE3）、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；六联组氨酸纯化镍柱、山羊抗兔IgG、HRP-DAB底物显色试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；日本大耳兔购自湖北省实验动物研究中心。
1.2 引物设计
参照GenBank公布的猪链球菌2型05ZYH33的1910rr基因核苷酸序列，用Primer5设计一对引物：上游引物RrI：5′-CGCCGGATCCATGCATAAGATGTTAGTAGTTGAT-3′，下游引物RrII：5′-CGCCAAGCTTTCATTCTGTCTGTAATTGACCGAT-3′。在上、下游引物分别引入BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位点。
1.3 1910rr基因的扩增
使用合成的引物RrI/RrII扩增出1910rr基因后于1%琼脂糖凝胶电泳分析，观察其条带大小是否符合预期。
1.4 pET30a-1910rr原核表达质粒的构建
1910rr基因与pET-30a经BamHⅠ/Hind Ⅲ双酶切处理后，以T4 DNA连接酶连接，转化到E.Coli DH5α感受态细胞中，提取质粒后BamHⅠ/Hind Ⅲ双酶切鉴定，阳性重组质粒命名pET30a-1910rr，送至北京擎科新业生物技术有限公司测序。
1.5 pET30a-1910RR融合蛋白的诱导表达
将阳性重组质粒pET30a-1910rr转化宿主表达菌株BL21（DE3），挑取单个菌落接种于LB液体培养基（含25 mg/L卡那霉素）中，37 ℃培养箱过夜，再按1∶100比例转接到LB液体培养基，37 ℃、180 r/min培养1.5 h后加入终浓度为0.8 mmol/L 的IPTG，22 ℃诱导12～16 h。
1.6 pET30a-1910RR融合蛋白的分离与纯化
上清的制备：诱导1 L阳性重组质粒pET30a-1910rr转化菌，10 000 r/min离心10 min收集菌体，用Buffer A重悬菌体，冰浴条件下超声波破碎菌体（功率200 W，破碎1 s，停1 s）共破碎30次。裂解后菌液10 000 r/min离心30 min，收集上清。
上清的纯化：用平衡液平衡柱子后，将上清加入Ni-NTA Beads中， 充分结合后加入20 mmol/L咪唑洗涤杂蛋白， 最后用75 mmol/L咪唑洗脱液进行洗脱，12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白纯化情况。
1.7 1910RR蛋白多克隆抗体的制备
纯化后的1910RR蛋白皮下多点免疫日本大耳兔，14 d免疫一次，首免前采血分离血清用于阴性对照。首免用弗氏完全佐剂，加强免疫均用弗氏不完全佐剂。前两次蛋白免疫量为6 mg/只，第3次和第4次免疫时剂量为12 mg/只。第4次免疫后7 d采血， 用琼脂糖免疫扩散试验检测抗体效价，达到预期效果后，心脏采血后37 ℃静置1 h，10 000 r/min离心15 min分离血清，-80 ℃保存。
1.8 Western-blot鉴定重组蛋白免疫原性
将纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将重组蛋白条带转移到NC膜上，5%脱脂奶37 ℃封闭过夜。TBST洗涤3次，每次10 min，以3次免疫后的兔抗1910RR蛋白血清按1∶100稀释作为一抗。37 ℃孵育1 h， TBST洗涤3次，每次10 min，1∶5 000稀释HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗，37 ℃作用1 h， TBST洗膜3次，DAB显色液显色至蛋白带清晰，去离子水终止反应。
1.9 琼脂免疫扩散试验检测多克隆抗体效价
琼脂平板打孔后，中间孔加入兔抗1910RR蛋白血清，周围孔加入2倍倍比稀释的重组蛋白，以此确定最佳抗原浓度；再将确定稀释好的重组蛋白加入中间孔，周围加入2倍倍比稀释的兔抗1910RR蛋白血清，出现沉淀线的最大稀释度即为抗体效价。
2 结果与分析
2.1 1910rr基因的PCR扩增结果
使用合成的引物RrI/RrII扩增1910rr基因。如图1所示，PCR扩增出1 200 bp左右的片段，与预期片段1 290 bp大小一致。
2.2 重组表达载体的酶切鉴定
如图2所示，pET30a-1910rr重组表达载体经BamHⅠ/Hind Ⅲ双酶切后出现2条带，分别在5 000 bp左右和1 200 bp左右，与预期的5 422 bp和1 290 bp条带大小一致。阳性重组质粒pET30a-1910rr经北京擎科新业生物技术有限公司测序，1910rr基因序列完全正确且读码框无误。
2.3 pET30a-1910RR融合蛋白的表达与纯化
用0.8 mmol/L的IPTG分别诱导12～16 h后，转化了重组质粒pET30a-1910rr的BL21（DE3）均表达出56 ku的融合蛋白，而且诱导量无明显差异。以上清形式表达的重组蛋白和六联组氨酸镍柱结合后用75 mmol/L咪唑浓度的洗脱液进行洗脱。如图3所示，上清纯化前目的蛋白条带很浓，而纯化后的上清无目的蛋白条带，说明目的蛋白与六联组氨酸镍柱的结合效果很好；洗脱液里出现明显目的蛋白条带，杂带很少，得到较纯净的目的蛋白。
2.4 Western-blot鉴定重组蛋白免疫原性
将纯化后的融合蛋白与重组蛋白免疫4次后的兔血清反应，Western-blot验证血清中多克隆抗体的存在。如图4所示，Western-blot可以检测到在56 ku处有一明显条带出现，证实纯化后的目的蛋白可被兔血清识别，多克隆抗体的制备是成功的。
2.5 琼脂免疫扩散试验检测抗体效价
琼脂平板打孔后，中间孔加入兔抗1910RR蛋白血清，周围孔加入2倍倍比稀释的重组蛋白，以此确定最佳抗原浓度为1.0 mg/mL。中间孔加1.0 mg/mL的1910RR蛋白，兔抗1910RR蛋白血清以2倍倍比稀释，检测结果兔抗1910RR蛋白血清效价为1∶4（图5）。
3 小结与讨论
猪链球菌2型SC19菌株双组分1910HK/RR缺失后，在TSB培养基中生长速率明显变慢，毒力显著下降，与野生株相比有219个基因转录水平发生了变化，其中105个基因下调表达1.5倍以上，114个基因上调1.5倍以上[8]。因此，本研究以猪链球菌2型1910RR蛋白为研究对象，通过大肠杆菌原核表达系统表达猪链球菌2型1910RR蛋白并制备了多克隆抗体，为进一步研究1910RR蛋白功能奠定物质基础。
原核表达系统表达的蛋白多以无活性的包涵体形式存在，包涵体主要是由于蛋白合成过快、过多、还来不及正确折叠和二硫健未能正确配对，相互聚积而成[9]。包涵体蛋白大多没有活性，需要变性复性，而且纯化效果不好。通过降低IPTG浓度、转速、温度等条件，降低蛋白的合成速率，可以在一定程度上增加蛋白的可溶性表达[10]。以上清形式表达的可溶性融合蛋白的His残基是暴露的，所以其更易与六联组氨酸镍柱结合，纯化效果要比包涵体好，而且不需要变性复性。在本研究中，重组质粒pET30a-1910rr转化大肠杆菌表达菌株后，通过添加0.8 mmol/L的IPTG诱导，发现pET30a-1910RR融合蛋白主要以包涵体的形式表达。通过蛋白表达温度的摸索，获得了在低温（22 ℃）条件下以上清形式表达的pET30a-1910RR融合蛋白。
Western-blot鉴定结果表明，制备的融合蛋白pET30a-1910RR抗血清可以与重组蛋白反应，检测到血清中相应的多克隆抗体，说明重组蛋白具有较好的免疫原性。但是存在一些杂带，这在多克隆抗体的制备中是比较常见的，因为应用动物免疫方法制备的多克隆抗体通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。
本研究通过原核表达猪链球菌2型双组分调控系统1910HK/RR反应调控蛋白1910RR，免疫SPF日本大耳兔，制备了多克隆抗体，为运用CHIP-Seq技术研究双组分调控系统1910HK/RR与受调控基因的作用方式，并获得与反应调控因子1910RR蛋白结合的DNA序列及核心位点奠定物质基础。
参考文献：
[1] MAZOKOPAKIS E E，KOFTERICLIS D P，PAPADAKIS J A，et al. Firstcase report of Streptococcus suis septicaemia and meningitisfrom Greece[J]. Eur J Neurol，2005，12（6）：487-489.
[2] LOPRETO C，LOPARDO H A，BARDI M C，et al. Primary Streptococcus suis meningitis： First case in humans described inLatin America[J]. Enferm Infect Microbiol Clin，2005，23（2）：110-111.
[3] TANG J Q， WANG C J， FENG Y J， et al. Streptococcal toxic shock syndrome caused by Streptococcus suis serotype 2[J]. PLoS Med， 2006， 3（5）： e151.
[4] SEGURA M，GOTTSCHALK M， OLIVIER M. Encapsulated Streptococcus suis inhibits activation of signaling pathways involved in phagocytosis[J].Infect Immun， 2004，72：5322-5330.
[5] STAATS J J，PLANNER B L，STEWART G C，et al.Presence of the Streptococcus suis suilysin gene and expression of MRP and EF correlates with high virulence in Streptococcus suis type 2 isolates[J].Vet Microbiol，1999，70 （3-4）：201-211.
[6] 尉 研.猪链球菌2 型二元调控系统2148hk/rr的研究[D].北京：中国人民解放军军事医学科学院，2011.
[7] 贾志平.猪链球菌2型双组份调控系统CiaRH调控基因SSU05-2036和SSU05-2039的功能研究[D].武汉：华中农业大学，2014.
[8] 袁芳艳.双组分调控系统1910HK/RR调控猪链球菌2型致病性研究[D].武汉：华中农业大学，2010.
[9] 朱红裕，李 强.外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达策略[J].过程工程学报，2006，6（1）：150-155.
[10] 杨汉春.动物免疫学[M].北京：中国农业出版社，2003.