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摘要：目的 觀察归芪益元膏对重离子辐射旁效应损伤大鼠的影响，探讨其可能的作用机制。方法 将42只SPF级Wistar雄性大鼠随机分为空白对照组、单纯辐射组和归芪益元膏组。归芪益元膏组预先给予归芪益元膏灌胃2周，单纯辐射组和归芪益元膏组大鼠右肺予2 Gy 12C6+离子束单次照射，空白对照组不予照射。照射后6、12、24 h处死各组大鼠，检测外周血象及白细胞介素（IL）-6、转化生长因子-β1（TGF-β1）、IL-1β含量，HE染色观察大鼠肺组织病理形态。结果 与空白对照组比较，照射后12 h单纯辐射组大鼠血清IL-6、TGF-β1、IL-1β含量明显升高（P<0.01），外周血白细胞、红细胞、血小板、血红蛋白明显下降（P<0.01）；HE染色显示照射后24 h大鼠肺泡壁增厚，肺泡腔内有渗出物及炎性细胞浸润等病理改变。与单纯辐射组12 h比较，归芪益元膏组12 h大鼠IL-6、TGF-β1、IL-1β含量明显下降（P<0.01），血常规各项指标显著上升（P<0.01），大鼠肺组织病理损伤有一定的改善。结论 归芪益元膏对重离子辐射旁效应损伤具有防护作用。
关键词：辐射旁效应；重离子；归芪益元膏；转化生长因子-β1；白细胞介素-6；白细胞介素-1β；大鼠；雄性
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.011
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）07-0045-04
Abstract： Objective To discuss the protective effects of Guiqi Yiyuan Ointment on damages caused by heavy ion radiation induced bystander effects； To explore the possible mechanism. Methods Totally 42 Wistar male rats were randomly divided into blank control group， pure radiation group and Guiqi Yiyuan Ointment group. The Guiqi Yiyuan Ointment group was given Guiqi Yiyuan Ointment by gavage for two weeks in advance. Later the right lungs of the rats in the pure radiation group and Guiqi Yiyuan Ointment group were radiated once by 2 Gy 12C6+， while the blank control group received no radiation. 6， 12， 24 h after radiation all groups of rats were executed. Peripheral hemogram and the levels of IL-6， TGF-β1 and IL-1β in serum of the rats were examined. The changes of lung tissue pathology morphology in the rats were observed by HE staining. Results Compared with the blank control group， the contents of IL-6， TGF-β1 and IL-1β in serum of the pure radiation group increased obviously at 12 h after radiation （P<0.01）， and the amount of leukocyte， erythrocyte， blood platelet and hemoglobin distinctly declined at 12 h after radiation （P<0.01）； HE staining showed that the alveolar wall was thickened at 24 h after radiation， and there were exudate and inflammatory cell infiltration in the alveolar cavity. Compare with the pure radiation group at 12 h after radiation， the levels of IL-6， TGF-β1 and IL-1β in Guiqi Yiyuan Ointment group decreased significantly at 12 h after radiation （P<0.01）. Indexes of blood routine significantly increased （P<0.01）， and the pathological changes of lung tissue in rats improved （P<0.01）. Conclusion Guiqi Yiyuan Ointment can protect damages caused by heavy ion radiation induced bystander effects.
Key words： radiation induced bystander effects； heavy ion； Guiqi Yiyuan Ointment； TGF-β1； IL-6； IL-1β； rats； male
恶性肿瘤是威胁人类健康的主要疾病，放疗是治疗恶性肿瘤的重要手段之一。重离子因具有高线性传
能密度、高能量沉积峰、相对高的生物学效应等优点，成为理想的肿瘤放疗用射线[1-2]，但重离子放疗时也会对周围健康组织产生间接损伤，即辐射旁效应。辐射旁效应的机制目前尚未完全研究清楚，其防护是辐射生物学和临床放疗治癌领域的重要研究内容。中药因高效、低毒、防治结合等优点成为目前辐射防护剂的研究热点[3]。归芪益元膏源自清·程国彭《医学心悟》黄芪汤，加甘肃道地药材当归而成，全方具有益气滋阴、补肺益肾、养血活血的功效。本实验用归芪益元膏对重离子辐射旁效应损伤大鼠预先干预，观察其对重离子辐射旁效应的防护作用，并探讨其可能的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级健康雄性Wistar大鼠42只，2～3月龄，体质量（200±20）g，甘肃中医药大学实验动物中心，动物合格证号SCXK（甘）2015-0002。饲养于甘肃中医药大学SPF级实验动物中心，温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%。
1.2 药物及制备
归芪益元膏（黄芪、当归、熟地黄、麦冬、人参、枸杞子、五味子），方中原药材均由本校甘肃省高校中藏药化学与质量控制实验室魏舒畅教授提供并质量鉴定，符合国家药典标准。按处方剂量称取药材后，以水作溶剂，提取2次，第1次用水量为总药材剂量的8倍，第2次为总药材剂量的6倍，每次提取2 h。合并2次提取的药液，300目滤布过滤，减压浓缩，制成膏剂，甘肃中医药大学中药制药实验室完成。
1.3 主要试剂与仪器
白细胞介素（IL）-6、转化生长因子-β1（TGF-β1）、IL-1β试剂盒，北京欣博盛生物科技有限公司，批号R160315-003a、R160315-007a、R160707-107a。全自动动物血球分析仪（兰桥医学科技有限公司），低温高速离心机（Kendro公司，型号D37520），酶标仪（瑞士TECAN公司，型号Infinite F200），石蜡切片机、石蜡包埋机、石蜡脱水机（德国Leica公司），普通光学显微镜（日本OLYMPUS，型号BX-51）。
2 实验方法
2.1 分组及给药
采用随机数字表法将大鼠分为空白对照组（6只）、单纯辐射组（18只）和归芪益元膏组（18只）。归芪益元膏组大鼠每日予归芪益元膏16.4 g/kg灌胃（相当于临床成人剂量10倍），空白对照组和单纯辐射组予等量生理盐水灌胃。各组给药体积均为2 mL，连续2周。
2.2 干预
照射前大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉。单纯辐射组和归芪益元膏组大鼠右肺给予2 Gy 12C6+离子束单次照射，铅皮屏蔽身体其余部位，空白对照组予相同方式麻醉，但不予照射。重离子照射在中国科学院近代物理研究所兰州重离子加速器研究装置（HIRFL-CSR）的浅层肿瘤治疗终端上进行，束流为12C6+离子束。坪区照射，能量为165 MeV，LET为20 keV/μm，吸收剂量率为2 Gy/min，用空气电离室监测剂量，照射剂量为2 Gy。于照射后6、12、24 h处死各组大鼠6只，腹主动脉取血，部分置于血常规管行全血细胞分析，部分离心取上清液行ELISA检测。取出左肺、右肺，4%多聚甲醛固定。
2.3 指标检测
检测大鼠外周血白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT）计数，按ELISA试剂盒说明书检测并计算大鼠血清TGF-β1、IL-6、IL-1β浓度。4%多聚甲醛固定肺组织，脱水后石蜡包埋，切片，HE染色，镜下观察各组大鼠肺组织形态。
3 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行分析。服从正态分布的计量资料以—x±s表示，采用方差分析，两两比较采用LSD法。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 归芪益元膏对重离子辐射旁效应损伤大鼠外周血象的影响
与空白对照组比较，照射后12 h单纯辐射组大鼠WBC、RBC、PLT、HGB明显下降（P<0.01）；与单纯辐射组12 h比较，归芪益元膏组12 h大鼠WBC、RBC、PLT、HGB明显升高（P<0.01）。结果见表1。
4.2 归芪益元膏对重离子辐射旁效应损伤大鼠血清转化生长因子-β1及白细胞介素-6、1β含量的影响
与空白对照组比较，照射后12 h单纯辐射组大鼠血清TGF-β1、IL-6、IL-1β含量升高（P<0.01）；与单纯辐射组12 h比较，归芪益元膏组12 h大鼠TGF-β1、IL-6、IL-1β含量降低（P<0.01）。结果见表2。
4.3 归芪益元膏对重离子照射后24 h损伤大鼠肺组织形态的影响
左肺：空白对照组肺泡壁无增厚，无炎性细胞浸润，肺泡腔内无渗出物，肺泡壁毛细血管无充血、出血；单纯辐射组肺泡壁增厚，肺泡腔内有少量渗出物，有少量炎性细胞浸润；归芪益元膏组肺泡壁无增厚，肺泡腔内无渗出物，未见炎性细胞浸润，肺泡壁毛细血管无充血、出血。右肺：空白对照组同左肺；单纯辐射组肺泡壁增厚，肺泡腔内有渗出物，有炎性细胞浸润，肺泡壁毛细血管充血、出血；归芪益元膏组肺泡壁无增厚，肺泡腔内无渗出物，肺泡壁毛细血管无充血、出血，有少量炎性细胞浸润。见图1、图2。
5 讨论
从不断增加的辐射旁效应的相关报道来看，细胞因子在旁效应中的作用越来越受到重视。细胞因子是一种可溶性的多肽，在炎症的细胞信号转导过程中起重要作用，輻射可诱导大量的细胞因子如IL-6、TGF-β1等产生[4]。它们既通过细胞间通讯以旁分泌的形式产生，对邻近细胞造成影响，也能以自分泌模式影响远处细胞。因而，在辐射旁效应损伤信号传递中发挥重要作用。这些细胞因子及其细胞表面的特殊受体激活相关通路，这些通路反过来诱导细胞内的信号级联放大，影响靶细胞功能[5]。
TGF-β1参与了辐射相关旁效应的响应，是旁效应的重要中介物，能够提高旁效应细胞中活性氧和微核数量，TGF-β1的抑制剂能够降低旁效应损伤[6-7]。有研究表明，辐照后非靶组织中TGF-β1及其受体表达水平明显升高[8]。TGF-β1还是一种重要的化学趋化因子，可趋化肺泡巨噬细胞、中性粒细胞及淋巴细胞，合成释放IL-6等细胞因子，诱导炎症反应[9]。IL-6是一种多功能的生物活性多肽物质，可诱导以中性粒细胞为主的炎症细胞在局部聚集，生成活性氧，诱发氧化应激，造成组织炎症，活化的中性粒细胞又可分泌IL-1β、IL-8等炎症因子，构成复杂的炎症网络调控系统[10]。因此，本实验以TGF-β1、IL-6、IL-1β作为检测辐射旁效应的生物学指标。
本实验结果表明，2 Gy 12C6+离子束照射大鼠右肺部后12 h，大鼠血清中TGF-β1、IL-6、IL-1β明显升高，说明局部辐射诱导了TGF-β1、IL-6、IL-1β的高表达，且其表达存在着时间效应。由此我们分析，机体于照射后12 h逐步启动自身修复功能，对自身损伤进行修复。这与文献报道一致[11-13]，旁效应的时间效应因射线种类、剂量等因素而异。
HE染色结果表明，碳离子束照射后24 h，大鼠右肺、左肺病理改变以急性肺泡炎症为主，提示右肺局部照射后旁组织左肺产生类似的病理损伤，可能是照射后血清中旁效应信号因子TGF-β1、IL-6、IL-1β表达升高，经由血液循环系统引起左肺出现病理改变。
机体的造血系统对辐射最敏感，骨髓是主要的造血组织，电离辐射可以严重损伤骨髓的造血功能，导致造血细胞的有丝分裂停止，细胞更新中断，还可抑制造血免疫功能，发生出血综合征和感染并发症。骨髓造血功能受损在外周血象中的反映是各类血细胞数量下降。因此，通过检测外周血中血细胞的数量可以了解骨髓的造血功能，造血系统的恢复也是辐射损伤防护的基础环节[14-16]。本实验结果显示，大鼠右肺部受2 Gy 12C6+离子束照射后12 h，外周血WBC、RBC、PLT、HGB明显下降，表明局部照射也抑制了骨髓造血细胞的功能。
中医学虽无辐射及辐射旁效应的相关记载，但射线的致病特点如高能、快速、穿透力强等与中医毒邪的致病特点极为相似，故中医学将辐射旁效应急性损伤归于“毒邪致病”的范畴。毒邪性质酷烈，致病易直中脏腑，败坏形体，极易耗伤机体气血阴阳，使机体出现气血阴阳亏虚的现象[17]。毒邪袭肺，耗气伤阴血，肺脏气阴两虚，肺肾母子相及，病理上相互影响，累及肾中精气，致肾精不足，气阴两虚。肾精为脏腑之气的根本，肾阴为一身阴气之本，最终导致机体气阴两虚。气虚无力推动血行，瘀血阻滞，故辐射旁效应损伤的中医病机以气阴两虚为主，兼血虚血瘀。
实验结果表明，预先灌胃归芪益元膏，碳离子照射大鼠血清中TGF-β1、IL-6、IL-1β含量较单纯辐射12 h大鼠明显下降，外周血WBC、RBC、PLT、HGB升高，对病理损害有一定的改善作用。表明归芪益元膏能降低辐射后大鼠血清中TGF-β1、IL-6、IL-1β的表达，推测归芪益元膏通过抑制TGF-β1的合成，进而减少IL-6、IL-1β的合成释放，减轻炎症反应，保护外周血象，从而起到防护辐射旁效应损伤的作用。
综上所述，归芪益元膏具有减轻辐射旁效应损伤的作用，其作用机制可能与抑制旁效应信号因子TGF-β1的合成，进而减少IL-6、IL-1β的合成释放，减轻炎症反应，保护外周血象有关，但是否通过调控其他靶点而发挥作用，还需进一步研究。
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（收稿日期：2016-11-22）
（修回日期：2016-12-22；编辑：华强）