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【摘要】 目的：观察CFA致炎大鼠脊髓腰膨大组织内miRNA-133b-3p与P2X4受体表达的相关关系。方法：大鼠足底注射CFA后，0 h、2 h、1 d、3 d检测大鼠机械痛和热痛的痛阈值变化，且在这四个时间点取脊髓腰膨大组织，提取总RNA和蛋白质，检测miRNA-133b-3p表达量的变化，同时检测P2X4受体mRNA和蛋白的表达量的变化。结果：与对照组相比，大鼠脚掌注射CFA后，机械痛和热痛痛阈均明显下降（P<0.05），在2 h时痛阈最低，1 d和3 d时较2 h略有回升；腰膨大部位miRNA-133b-3p表达量在2 h时没有变化，1 d和3 d开始呈现逐渐下降的趋势（P<0.05），四个时间点P2X4受体mRNA表达量比较差异均无统计学意义（P>0.05），但P2X4受体蛋白在3 d时表达量显著升高（P<0.05）。结论：CFA致炎大鼠脊髓腰膨大组织miRNA-133b-3p表达下调，同时P2X4受体表达上调，两者可能存在负向调控关系。
【关键词】 慢性痛； CFA； 腰膨大； miRNA-133b-3p； P2X4受体
Expression of MiRNA-133b-3p and P2X4R in Lumbar Spinal Cord of CFA-induced Inflammatory Pain Rats/GAO Yang，HE Ze-ping，WANG Rui，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（26）：025-028
【Abstract】 Objective： To observe the expression pattern of miRNA-133b-3p and P2X4R in lumbar spinal cord of complete Freund’s adjuvant（CFA）-induced inflammatory pain rats.Method：CFA was intraplantar injected to the rats.Then we measured the threshold to mechanical stimuli and noxious thermal stimuli at 0 h，2 h，1 d and 3 d after CFA injection.After the behavior observation，the lumbar spinal cord were isolated from the rats，and the total RNA and protein were extracted for the detection of miRNA-133b-3p，P2X4R mRNA and P2X4R protein.Result：Compared with the control group，the threshold of rats to mechanical stimuli and noxious thermal stimuli decreased and peaked at 2 h after CFA injection（P<0.05），then recovered slightly at 1 and 3 d（P<0.05）.The expression of miRNA-133b-3p did not change at 2 h，and decreased gradually at 1 and 3 d after CFA injection（P<0.05）.P2X4R mRNA expression had no significantly change after CFA injection（P>0.05），but P2X4R protein increased significantly at 3 d after CFA injection（P<0.05）.Conclusion：The expression of miRNA-133b-3p is decreased in lumbar spinal cord of CFA-injected inflammatory pain rats，meanwhile，the expression of P2X4R protein is increased.There may be a negative relationship between miRNA-133b-3p and P2X4R.
【Key words】 Chronic pain； CFA； Lumbar spinal dorsal cord； MiRNA-133b-3p； P2X4R
First-author’s address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.26.007
國际疼痛学会（IASP）指出疼痛是组织损伤或潜在组织损伤所引起的不愉快感觉和情感体验。慢性疼痛是目前严重影响人类生存质量的一种疾病，现有镇痛治疗常疗效欠佳且伴发一系列的副作用，慢性疼痛的发病机制仍需深入研究。脊髓敏感化是慢性疼痛形成的重要成因之一[1]。研究发现慢性疼痛发生时脊髓组织内很多蛋白表达水平发生了改变，包括神经递质、细胞因子等[2-5]。寻找这些蛋白表达的调控机制将可能为慢性疼痛的治疗提供更多证据。
microRNA（miRNA）是由20～23个核苷酸组成的单链非编码RNA。在生物体内miRNA可以与一个或者多个mRNA的3’UTR区互补，降解或抑制靶基因mRNA，从而抑制靶基因的表达[6]。
笔者采用高通量的miRNA array方法筛选了CFA炎性痛模型大鼠背根神经节（DRG）组织内的差异表达miRNA，结果发现miRNA-133b-3p在CFA大鼠DRG组织中表达下调。用生物信息学软件分析靶标基因，发现miRNA-133b-3p存在与P2X4受体基因的3"UTR区相匹配的区域。因此miRNA-133b-3p是P2X4受体基因表达的可能调节者之一。
P2X4受体是P2X受体七种亚型之一。ATP激活受体后引起阳离子（Na+、K+、Ca2+）非选择性内向整流。研究发现P2X4受体参与脊髓小胶质细胞的活化，在脊髓敏感化及慢性疼痛中发挥重要的作用。
基于以上结果，笔者以脚掌注射CFA的SD大鼠为慢性炎性痛模型，在体观察大鼠脊髓腰膨大miRNA-133b-3p和P2X4受体在CFA注射后不同时间段的表达情况，明确miRNA-133b-3p和P2X4受体表达的相关关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物 200～250 g的SPF级大鼠，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。大鼠饲养于22 ℃的恒温环境中，保持12 h照明/黑暗的昼夜节律，自由进食和饮水。动物实验过程符合实验动物管理条例。
1.2 动物分组与模型制备 48只大鼠随机分为对照组（n=24）与实验组（n=24）。对照组动物脚掌注射生理盐水100 μL，实验组动物脚掌注射CFA 100 μL（F5881，Sigma）。
1.3 机械痛测定（Von Fery Test） 机械痛测定使用的是50%缩足阈（Fifty percent paw withdrawal threshold）的方法[7]，测量时用1、1.4、2、4、6、8、10、15 g八根Von Fery针，从4 g开始在，如果大鼠抬脚，记为“X”，则依次增大克数测试；如果大鼠不抬脚，记为“O”，依次减少克数测试。6次有效反应从第一次不同于前一次反应的前一次反应开始。大鼠一直没有反应至15 g或1 g，痛阈记为15 g和1 g。
1.4 热痛测定（Von Fery Test） 检测时室温维持在20～25 ℃，大鼠环境适应30 min。热辐射光源（8 V，50 W）照射大鼠注射侧脚掌，记录光源打开至大鼠缩足的间隔时间， 20 s后热辐射停止。每只大鼠测量3次，间隔时间为5 min，取平均值。
1.5 总RNA提取 大鼠麻醉取出左侧脊髓腰膨大，液氮速冻；用miRNeasy Mini Kit（217004，Qiagen）按照操作说明提取总RNA；测量RNA浓度，-80 ℃冰箱保存。
1.6 microRNA荧光定量PCR 根据操作说明采用microRNA反转录试剂为miScript Ⅱ RT Kit（Qiagen）进行反转录。采用The miScript SYBR Green PCR Kit（Qiagen）对cDNA进行荧光定量。引物由Invritrogen和Qiagen公司设计合成。
1.7 mRNA荧光定量PCR 采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TARAKA）進行mRNA反转录。利用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（TAKARA），进行荧光定量。引物由Invritrogen公司设计合成。
1.8 Western Blotting 将大鼠麻醉取出左侧脊髓腰膨大，液氮速冻；组织超声破碎后测定蛋白质浓度；40 μg/孔上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭；P2X4一抗（13534-1-AP，Proteintech，1∶500）孵育；山羊抗兔二抗孵育1 h；ECL超敏化学发光，GChemiDoc MP成像系统成像，Imaging labTM软件分析。
1.9 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行分析，计量资料采用（x±s）表示，自身处理前后采用独立样本t检验，多组样本间均数比较用One-way ANOVA方差检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 炎性痛模型的制备 在CFA注射后0 h、2 h、1 d、3 d四个时间点检测了大鼠的机械痛和热痛痛阈的变化。
2.1.1 机械痛测量 50%痛阈结果显示（图1），实验组和对照组大鼠的基础痛阈比较差异无统计学意义（P>0.05）。CFA注射后2 h、1 d、3 d，实验组大鼠痛阈明显减低，与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.1.2 热痛测量 热痛痛阈结果显示（图1），0 h时两组比较差异无统计学意义（P>0.05），2 h、1 d、3 d 时两组相比，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.2 P2X4受体基因mRNA的表达量 qPCR检测腰膨大P2X4受体基因的表达量，actin为内参（图2）。与对照组相比，实验组注射CFA后P2X4受体基因mRNA的表达量2 h、1 d、3 d相比，差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.3 P2X4受体蛋白的表达量 Western Blot检测P2X4受体蛋白的表达量，GAPDH为内参蛋白（图3）。结果显示，2 h和1 d 两组比较，P2X4受体蛋白表达量比较，差异均无统计学意义（P>0.05），3 d时CFA组P2X4受体蛋白表达量显著上升（P<0.05）。
2.4 microRNA-133b-3p的表达量 qPCR检测腰膨大miRNA-133b-3p的表达量，U6为内参（图4）。与对照组相比，实验组miRNA-133b-3p的表达量在CFA注射后2 h时没有改变（P>0.05），1 d和3 d时表达量均显著下降（P<0.05）。
3 讨论
痛觉的产生是由感觉神经末梢感受到伤害性刺激，经由感觉神经纤维传导至脊髓背角，之后上传到丘脑，进而投射到大脑皮质，最终产生痛觉。炎性痛为生活中最常见的疼痛之一，表现为痛觉过敏、痛觉异常和触诱发痛。炎性痛的形成机制很复杂，包括发生在外周组织的敏化以及中枢敏化，而脊髓水平的敏化与神经胶质细胞活化密切相关[8]。
图4 注射CFA后腰膨大miRNA-133b-3p的表达情况
大鼠左側脚掌注射生理盐水，没有出现炎性反应，且行动正常。大鼠左侧后脚掌注射CFA后，患侧脚掌出现红、肿等炎性反应，运动时患侧脚掌离地，轻抬脚掌，经常舔舐患侧脚掌。痛行为可以看出2 h后实验组痛阈显著下降，并且在3 d内痛阈维持在较低的水平。以上说明CFA炎性痛大鼠模型制备成功。
在炎性痛痛觉上传的过程中伤害性的刺激激活或调节脊髓背角许多基因的表达，如c-fos[9]、Cox-2[10]和nNOS[11]等，同时会激活脊髓背角神经胶质细胞[12]。当炎症发生时，脊髓中小胶质细胞对细胞外环境敏感，最先被激活[13]，膜表面受体上调。炎症或神经损伤后组织内液ATP及其代谢产物增多[14-16]，可以作用于小胶质细胞P2X4和P2X7等受体形成疼痛[17-18]。P2X4受体是小胶质细胞激活的必要条件[19]。在神经病理痛时，患侧脊髓背脚小胶质细胞高表达P2X4受体。鞘内注射P2X4受体激活的小胶质细胞可以诱发小鼠痛敏，且阻断P2X4受体后痛敏明显缓解[20]。脊髓损伤模型中P2X4-/-小鼠痛敏阈值明显高于正常对照小鼠[21]。外周神经损伤模型大鼠脊髓小胶质细胞被激活，激活的小胶质细胞P2X4受体上调且释放BDNF，参与神经病理痛的形成[22]。在脑脊髓炎时，大鼠脊髓背脚中P2X4受体表达上调，且与小胶质细胞共定位[23]。尾静脉注射P2X4受体反义链可以抑制NLRP1炎症信号通路减轻大鼠胶原导致的关节炎症状[24]。脚掌注射CFA炎性痛模型中P2X4-/-小鼠痛敏阈值明显高于正常对照小鼠[25]。
在CFA大鼠脚掌注射前和注射后2 h、1 d、3 d四个时间点取大鼠脊髓腰膨大，检测P2X4受体基因mRNA和蛋白的表达量及miRNA-133b-3p的表达量。结果发现，在CFA注射前后，P2X4受体mRNA表达量均无差别，但P2X4受体蛋白表达呈上升趋势，且在3 d时蛋白表达显著增加。
microRNA作为一种转录后调节基因翻译的非编码RNA，与一个或多个靶基因3’UTR区结合，抑制mRNA翻译[25]。miRNA-133b-3p在CFA注射后1 d时开始显著下调，且3 d时表达较1 d时更低。实验现象观察得出，炎症发生时脊髓腰膨大部位miRNA-133b-3p的表达量下降，P2X4受体mRNA表达量没有改变，但P2X4受体蛋白的表达增高。
本实验证实脊髓腰膨大组织内miRNA-133b-3p与靶基因P2X4受体表达之间存在负向关系。结果提示，CFA致炎性痛模型脊髓背角miRNA-133b-3p表达减少，抑制P2X4受体表达的作用减弱，导致P2X4受体表达上调，促进了小胶质细胞的活化，继而产生疼痛。
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（收稿日期：2017-05-02） （本文編辑：程旭然）