（中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所，北京100850）
[摘要]目的：制备γ环糊精-C60超分子化合物，改善C60的水溶性和血液相容性。方法：采用研磨法制备γ环糊精-C60超分子化合物，利用红外光谱对其结构进行表征，通过溶血实验及血浆复钙实验对C60、γ环糊精-C60的血液相容性进行评价。结果：红外光谱结果表明γ环糊精与C60发生包埋，γ环糊精-C60在双蒸水中放置24h无聚沉，样品浓度为512μg/mL 、102.4μg/mL 、25.6μg/mL时，C60的溶血率分别为13.75%±0.26%、6.02±0.12%、3.21±0.19%，γ环糊精-C60的溶血率分别为3.74%±0.39%、1.13%±0.12%、0.55%±0.19%；阳性对照、C60、γ环糊精-C60的复钙时间分别为10min 、15min、20min，对应吸光度值分别为1.09、0.68、0.51 。结论：经γ环糊精修饰后C60的水溶性和血液相容性得到改善。
[关键词]C60；γ环糊精；水溶性；血液相容性
中图分类号：O657文献标识码：A文章编号：2095-5200（2014）04-001-03
DOI：10.11876/mimt201404001
Preparation of water-soluble fullerene C60 and its hemocompatibility studyLIU Yan，SUN lan，YAO Hong-juan，ZHANG Ying-ge.（Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850）
[Abstract]Objective：To improve the water-solubility of C60, γ cyclodextrin-C60 supramolecular compounds were prepared. Methods：γ cyclodextrin-C60 supramolecular compounds were prepared by grinding way. The structure of γ cyclodextrin-C60 was characterized by infrared spectroscopy. Then, through the hemolysis experiment and plasma recalcification experiment, the hemocompatibility of C60 and γ cyclodextrin-C60 have been evaluated. Results：FTIR results showed that the γ cyclodextrin embedded with C60. γ cyclodextrin-C60 placed 24h without coagulation in double distilled water. In the concentration of 512μg/mL, 102.4μg/mL, 25.6μg/mL the hemolysis rate of C60 were 13.75% ± 0.26%, 6.02 ± 0.12%, 3.21 ± 0.19% respectively, while γ cyclodextrin-C60 were 3.74% ± 0.39%, 1.13% ± 0.12%, 0.55% ± 0.19% respectively. Recalcification time of positive control, C60 and γ cyclodextrin-C60 was 10min, 15min, 20min and the corresponding absorbance values were 1.09,0.68,0.51. Conclusion：γ cyclodextrin modification can improve water-solubility and hemocompatibility of C60.
[Key words]C60；γ cyclodextrin；water-solubility；hemocompatibility1985年Kroto等首次发现了碳的第三种同素异形体富勒烯C60 [1]，1990年Krätschmer采用石墨电弧放电的方法分离出了克量级C60，使得C60的研究迅速发展起来[2]。近年来相关研究发现C60具有良好的医学应用前景，如可以作为药物载体[3]、抗艾滋病药物[4]、光动力学杀伤肿瘤药物[5]、X射线对照剂[6]等。但C60的理化性质表现出高度疏水性和不良的血液相容性，使其发展受到限制。为改善C60的水溶性和血液相容性，可以对C60进行功能化修饰，通过引入羟基、羧基等极性官能团来提高C60的亲水性和减少血浆蛋白的黏附。本研究采用研磨法制备γ环糊精- C60超分子化合物，并对其水溶性和血液相容性进行了评价。
1仪器与试剂
C-120S精密电子分析天平（Sartorius，德国），行星式高能球磨机（P7型，德国），离心机（TGL-16G，上海安亭科学仪器厂），旋转式恒温振荡器（DSHZ-300A，太仓市实验设备厂），红外光谱仪（Bruker Vertex 70，德国）C60（濮阳市永新富勒烯科技有限公司，纯度99.9%），γ环糊精（damas-beta，瑞士），0.9%氯化钠注射液（石家庄四药集团），氯化钙（北京化学试剂公司，纯度≥95%），成人全血（中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所提供）。
2实验方法与结果
2.1C60的修饰改性
2.1.1γ环糊精- C60超分子化合物制备称取54mgγ环糊精与25mg C60以800 r/mim研磨4h，收集研磨产物于锥形瓶中，加入20mL双蒸水，置于恒温振荡器摇振30min（温度：37℃、转速：100 r/min），将混悬液以16000 r/min离心5min，弃下层沉淀，上清液在-20℃冷冻8h后，放入冻干机中干燥。
2.1.2C60与γ环糊精- C60的水溶性C60/双蒸水、γ环糊精- C60/双蒸水样品放置24h后，C60产生聚沉，微溶于水，γ环糊精- C60仍能保持稳定的分散状态，无沉淀析出，如图1所示。
图1C60（左）与γ环糊精-C60（右）在水中的溶解性
2.2结构表征
采用溴化钾压片法测定C60、γ环糊精、γ环糊精- C60的红外光谱，谱图结果如图2所示。
γ环糊精和C60的红外测定结果与文献报道相一致[7-8]。在γ环糊精-C60的红外光谱中：1427.6、575.8、526.3cm-1处为C60的特征吸收峰，3401.7、2925.3、1155.4、756.1、704.6 cm-1处为γ环糊精的特征吸收峰，说明γ环糊精与C60发生了包埋。
2.3溶血率测定
（1）将8 mL成人全血用10 mL 生理盐水稀释。（2）分别称取6.4 mg C60和γ环糊精- C60，用生理盐水配制成浓度为512μg/mL、102.4μg/mL、25.6μg/mL的样品，于37℃恒温放置30 min，向各样品中加入0.2 mL（1）中所配稀释血液，轻轻摇匀后于37℃放置60 min，以1500 r/min离心10 min，吸取上清液0.1 mL加入到96孔板中。（3）配制阳性对照样品：0.2 mL稀释血液与10 mL超纯水混匀；配制阴性对照样品：0.2 mL稀释血液与10 mL 生理盐水混匀；将阳性对照和阴性对照样品以0.1 mL/孔加入到96孔板中。（4）在545nm处测定吸光度值。溶血率测定结果如图3所示。
溶血率（%）=（测试样吸光度值-阴性对照吸光度值）/（阳性对照吸光度值-测试样吸光度值）
由图3可知，样品浓度为512μg/mL 、102.4μg/mL 、25.6μg/mL时，C60的溶血率分别为13.75%±0.26%、6.02%±0.12%、3.21%±0.19%，γ环糊精- C60的溶血率分别为3.74%±0.39%、1.13%±0.12%、0.55%±0.19%。结果表明C60经γ环糊精修饰后溶血率降低。
2.4血浆复钙时间测定
（1）以1000 r/min将成人全血离心10 min，弃下层血小板，得到去血小板血浆；（2）称取30 mg氯化钙，用双蒸水溶解，配制浓度为0.025mol/L的氯化钙水溶液；（3）称取C60和γ环糊精- C60各6.4 mg，用生理盐水配制成浓度为512μg/mL的样品，于37℃恒温放置30 min；（4）向96孔板各孔中加入去血小板血浆、0.025 mol/L的氯化钙水溶液和待测样品各100μL，在405nm处测定复钙时间动力学曲线，间隔5 min采样一次；（5）阳性对照组采用100μL去血小板血浆加100μL 0.025 mol/L的氯化钙水溶液，阴性对照组采用100μL去血小板血浆。
图4血浆复钙动力学曲线的测定结果显示：阳性对照组、C60、γ环糊精- C60复钙时间分别为10min、15min、20min，对应的吸光度值分别为1.09、0.68、0.51，说明C60经环糊精修饰后复钙时间延长，生成沉淀减少。
图 4血浆复钙时间动力学曲线
3讨论
γ环糊精是一种内腔疏水外缘亲水的两亲型化合物，其分子内空腔表面仅存在糖苷氧原子及覆盖糖苷氧原子的氢原子而表现出疏水性，空腔尺寸为0.9-1nm大于C60的结构尺寸，可以通过疏水作用对C60进行包埋形成超分子化合物，这种超分子化合物因γ环糊精外缘含有丰富的羟基而具有良好的水溶性，是一种提高C60水溶性的有效途径。
溶血实验是考察受试材料的血液相容性，评价其对红细胞损害程度的一种方法。当材料与血液接触后可引起血红蛋白变性从而导致血液凝固和血栓的形成，溶血率越低表明材料的血液相容性越好。采用γ环糊精对C60修饰后，各剂量组的溶血率均下降，达到了美国材料试验协会（ASTM）认可的溶血率低于5%的良好血液相容性标准。血浆复钙实验结果显示经γ环糊精修饰后C60的复钙时间延长，生成沉淀减少，说明抗凝血性得到了提高。这主要是因为γ环糊精外缘含有大量羟基而带有负电，可以与同样带有负电荷的血浆蛋白产生排斥从而减少血浆蛋白的粘附。综上所述，采用γ环糊精对C60进行修饰可以增强其水溶性，改善其血液相容性，为C60在生物医药领域的进一步应用奠定基础。
参考文献
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