[摘要]研究热毒宁注射液对大鼠肝脏CYP450酶酶活性及其mRNA表达水平的影响。将SD大鼠腹腔注射7 d后，处死，制备大鼠的肝微粒体，与探针药物共孵育，利用LC/MS法测定各同工酶特异性底物在大鼠肝微粒的代谢产物的生成量，间接反映各同工酶的活性。应用荧光定量PCR技术考察热毒宁注射液对大鼠肝脏CYP450酶mRNA表达水平的影响。结果显示，酶活性方面，热毒宁注射液与空白组比较可抑制CYP2B1，2C12，2C13，2D2的酶活性，诱导CYP3A1的酶活性，对CYP1A2酶活性无明显影响。mRNA表达方面，热毒宁注射液对CYP2B1，3A1，1A2，2C11，2D1，2E1 mRNA的表达具有诱导作用。通过对上述结果分析，可以看出热毒宁注射液在酶活性和mRNA水平均对CYP3A1具有显著的诱导作用，与大环内酯类抗生素合用时可能会出现不良反应;对CYP2B1，2C12，2C13，2D2的酶活性均具有抑制作用，与其他药物联合用药时要充分考虑可能出现的药物相互作用或潜在风险。
[关键词]热毒宁注射液;细胞色素P450酶;Cocktail探针法;荧光定量PCR技术
Effects of Reduning injection on activity of hepatic microsomal
CYP450 isozymes in rats
ZHANG Yun-yan1， XU Wang-yanjun2， TANG Xiang-lin1*， MA Zeng-chun1， WANG Yu-guang1， LIANG Qian-de1，
TAN Hong-ling1， XIAO Cheng-rong1， WANG Zhen-zhong3， XIAO Wei3， GAO Yue1*
（1. Institute of Radiation Medicine， Academy of Military Medical Science， Beijing 100850， China;
2. Anhui Medical University， Hefei 230032， China;
3.Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China）
[Abstract]To research the influence of Reduning injection on the activity and mRNA expression of cytochrome P450（CYP450） system in rat liver microsomes. Rat liver microsomes were prepared after a seven-days continuous administration of Reduning injection. An HPLC-MS method was applied to determine the specific metabolites of CYP450 probe substrates in rat liver microsomal incubations. The activity of CYP450 isozymes were represented by the formation of metabolites. The Real-time quantitative polymerase chain reaction （Q-PCR） was applied to determine the mRNA expression levels of CYP450. Reduning injection significantly reduced the activity of CYP2B1，2C12，2C13（P<0.01）， but did not affect CYP1A2; low dose and high dose of Reduning injection had an inhibition trend on the activity of CYP2D2， but did not statistically differ from control group; low dose of Reduning injection significantly induced the activity of CYP3A1（P<0.01）， high dose of Reduning injection had an induce trend on the activity of CYP3A1， but did not statistically differ from control. At the mRNA level， low and high dose of Reduning injection had an induce trend on the expression of CYP1A2， 2C11， 2D1， 2E1， 3A1， but did not statistically differ from control. Reduning injection significantly induced the activity of CYP2B1. Reduning injection significantly induced the activity of CYP3A1 in mRNA expression and enzyme activity levels， which may result adverse drug reaction after being combined with macrolides antibiotics. Reduning injection significantly reduced the activity of CYP2B1， 2C12， 2C13， 2D2 in enzyme activity levels， when combined with other drugs， it should be fully taken into account of the possible drug-drug interaction in order to avoid adverse side effects.
[Key words]Reduning injection; cytochrome P450; Cocktail probe method; Q-PCR
doi：10.4268/cjcmm20151411
热毒宁注射液处方源于名老中医经验方，由青蒿、金银花和栀子3味药经现代工艺提取精制而成，是国家二类新药。热毒宁注射液具有清热、解毒、疏风等作用，临床上用于外感风热所致感冒、咳嗽，上呼吸道感染及急性支气管炎等。现代药理学研究，热毒宁注射液有解热、镇痛、抗病毒、提高机体免疫力、抗菌抗炎等作用<sup>[1]</sup>。
药物之间的相互作用主要由细胞色素CYP450 酶系介导，CYP450酶参与了绝大多数内源性和外源性分子的生物代谢过程，尤其是对药物的代谢。研究中药对CYP450酶系的影响对保证临床药物作用的安全性和有效性具有极其重要的意义<sup>[2]</sup>。但是，目前关于热毒宁注射液对药物代谢酶影响的研究很少。因此，本文将采用Cocktail探针法结合LC/MS技术<sup>[3-4]</sup>，测定热毒宁注射液对大鼠CYP450同工酶酶活性的影响，同时利用荧光定量PCR技术<sup>[5]</sup>对大鼠CYP450同工酶mRNA表达进行检测，试图从2个层面研究热毒宁注射液对药物代谢酶亚型的影响，为临床合理用药提供依据。
另外，在热毒宁注射液的临床试验中，药品不良反应发生率为0.38%<sup>[6]</sup>。热毒宁注射液不良反应的发生与用药总量、合并用药等因素有关，在是否有合并用药因素中，抗微生物药、大环内酯类药物有非常显著性差异。本文试图从热毒宁注射液对大鼠肝脏细胞色素CYP450酶影响的角度解释热毒宁注射液产生的不良反应，为热毒宁注射液的临床合理用药提供依据。
1材料
1.1药品与试剂
热毒宁注射液（江苏康缘药业股份有限公司，批号121122）;非那西丁（phenacetin）、甲苯磺丁脲（tolbutamide）、右美沙芬（dextromethorphan）、咪达唑仑（midazolam）、扑热息痛（paracetamol）、普萘洛尔（propranolol）均购自中国食品药品检定研究院;安非他酮（bupropion）、S-美芬妥因（S-mephenytoin）、4-羟基甲苯磺丁脲（4-OH tobutamide）、右啡烷（dextrorphan）、1′-羟基咪达唑仑（1′-OH midazolam）、4-羟基安非他酮（4-OH bupropion）、4-羟基美芬妥因（4-OH mephenytoin）均购自美国BD公司;NADPH购自瑞士Roche公司;RNA提取试剂盒购自中国Biomed公司;逆转录酶及Q-PCR扩增试剂购自中国TransGen公司;甲醇和乙腈为色谱纯，购自美国Fisher;实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
1.2仪器
BS223S电子天平（德国Sartorious公司）;MDF-U53V超低温冰箱（日本Sanyo）;Agilent 1290型超高效液相色谱仪（UHPLC，美国Agilent公司）;Agilent 6410B型三重四极杆串联质谱仪（美国Agilent公司）;Agilent ZORBAX EclipsePlus-C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm，美国Agilent公司）;Optima L-XP超高速低温离心机（美国Beckman）;HW·SYⅡ-K水浴锅（北京市长风仪器仪表公司）;DY89-1匀浆机（中国宁波新芝生物科技有限公司）;PCR仪（美国Applied Biosystems GeneAmp PCR System2400）;Labofuge 400R高速低温离心机（德国Heraeus）。
1.3动物与分组
SD大鼠，220～260 g，雄性，由军事医学科学院动物实验中心提供。大鼠随机分为4组，每组9只，分别为空白组、苯巴比妥组、热毒宁注射液低、高剂量组。
2方法
2.1给药方案
苯巴比妥组腹腔注射给予50 mg·kg-1·d-1苯巴比妥，连续3 d，第4天制取肝微粒体;热毒宁注射液低剂量组（2 mL·kg-1，相当于生药剂量为0.52 mg·kg-1·d-1，相当于临床人用剂量）、热毒宁注射液高剂量组（6 mL·kg-1，相当于生药剂量为1.56 mg·kg-1·d-1，相当于3倍临床人用剂量）分别腹腔注射给予热毒宁注射液，连续7 d，第8天制取肝微粒体;空白对照组给予等量生理盐水，连续7 d，第8天制取肝微粒体。
2.2Cocktail探针法测定热毒宁注射液对大鼠肝脏CYP450酶活性水平的影响
2.2.1肝微粒体的制备及蛋白含量的测定各组大鼠给药结束后，禁食12 h，脱臼处死，迅速打开腹腔和胸腔，用注射器以4 ℃生理盐水由门静脉灌洗，结扎上腔静脉，灌洗至肝脏呈土黄色。将肝脏剪碎，按1∶4加入TMS缓冲液，冰浴中匀浆。匀浆液4 ℃，12 000×g离心20 min，弃沉淀。上清液4 ℃，105 000×g离心60 min，弃上清，沉淀部分即肝微粒体。按初始匀浆时每克肝组织加入1 mL Tris-HCl储存液（4 ℃），重悬微粒体，冰浴，玻璃匀浆管手动研磨，使微粒体均匀分散。分装微粒体，-80 ℃保存。上述操作均在冰浴条件下进行。使用博迈徳公司的BCA试剂盒测定肝微粒体蛋白含量，按试剂盒说明书进行操作。
2.2.2肝微粒体的体外孵育将肝微粒体与CYP450同工酶探针药物共同孵育，测定探针药物代谢产物的生成量来反映热毒宁注射液对CYP450同工酶的诱导或抑制作用。孵育体系包括肝微粒体（0.5 g·L-1），NADPH（1 mmol·L-1），CYP特异性探针底物美芬妥因（50 μmol·L-1）、非那西丁（10 μmol·L-1）、安非他酮（25 μmol·L-1）、咪唑达仑（2.5 μmol·L-1）、甲苯磺丁脲（25 μmol·L-1）和右美沙芬（5 μmol·L-1），K2HPO4/KH2PO4缓冲液（0.05 μmol·L-1，pH 7.4）补足体系至200 μL。37 ℃水浴预孵育5 min后加入同样预孵育5 min的NADPH启动反应，37 ℃水浴温孵育30 min，加入200 μL预冷的终止剂（普萘洛尔100 μg·L-1，溶剂为甲醇-乙腈 1∶1）终止反应。混悬5 min后，4 ℃ 13 000×g离心10 min，取上清液进样定量分析各底物的代谢产物生成率，测得酶活性。
2.2.3液质联用检测条件色谱条件：以流动相A（含0.1%甲酸和5 mmol·L-1甲酸铵的纯水）和B（含0.1%甲酸的乙腈）梯度洗脱：30%B（0～1.5 min），95%B（1.5～3.5 min），30%B（3.5～3.6 min），柱温25 ℃，流速0.45 mL·min-1，运行时间4.5 min;进样体积10 μL。内标为普奈洛尔（100 μg·L-1）。质谱条件：以 ESI源正离子MRM方式检测，毛细管温度320 ℃，毛细管电压+4 000 V，雾化电压25 psi，干燥气流速10 L·min-1，其他质谱分析参数见表1。
2.3荧光定量PCR技术测定热毒宁注射液对大鼠肝脏CYP450酶mRNA水平的影响
2.3.1大鼠肝组织总RNA的提取大鼠禁食12 h，脱臼处死，迅速取出肝脏，置于液氮中保存。按博迈徳公司RNA提取试剂盒说明书提取肝脏总RNA。用紫外分光光度计测定A260/A280，在1.7～1.9可用于下一步的实验。
2.3.2逆转录及实时定量聚合酶链式反应（Q-PCR）按TransGen公司逆转录及Q-PCR试剂盒说明书进行。取总RNA 1 μg，分别加入2×TS Reaction Mix 10 μL，Anchored Oligo（dT）181 μL，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，加入Rnase-free Water至终体积为20 μL 并混合均匀。反转录的条件为42 ℃ 30 min;85 ℃ 5 min。反转录产物保存在-20 ℃待用。反转录产物2 μL，加入2×TransStart Green Qpcr SuperMix 10 μL，Passive Reference Dye 0.4 μL，Forward Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL，加入RNase-free H2O至终体积为20 μL，荧光实时定量PCR的条件为94 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s;60 ℃ 30 s;40个循环。GAPDH为内参基因，进行PCR扩增的实时定量分析。实验重复测定3次。各亚型引物的序列见表2。
2.4数据分析
实验数据以±s表示，空白组和各给药组之间的差异的比较用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
3结果
3.1热毒宁注射液对大鼠肝脏CYP450酶酶活性的影响
利用Cocktail混合探针法对大鼠肝微粒体的酶活性水平进行测定。利用该法同时测定了不同剂量热毒宁注射液对大鼠肝脏6种亚酶酶活性的影响，见表3。结果显示，热毒宁注射液与空白组比较可抑制CYP2B1，2C12的酶活性（P<0.01），对CYP1A2酶活性无明显影响;低剂量组的热毒宁注射液可抑制CYP2C13的酶活性（P<0.01），高剂量组有抑制趋势，无统计学差异;低剂量组和高剂量组的热毒宁注射液可抑制CYP2D2的酶活性，无统计学差异;低剂量组的热毒宁注射液可诱导CYP3A1的酶活性（P<0.01），高剂量组有诱导趋势，无统计学差异。
3.2热毒宁注射液对大鼠肝脏CYP450酶mRNA表达的影响
利用荧光定量PCR技术考察了热毒宁注射液对大鼠肝脏6种CYP450同工酶mRNA表达的影响。
3.2.1CYP1A2 mRNA与空白组相比，苯巴比妥组CYP1A2 mRNA未发生明显改变，低剂量组和高剂量组对CYP1A2 mRNA的表达具有显著上调作用（P<0.01），见图1。
3.2.2CYP3A1 mRNA与空白组相比，苯巴比妥组和低剂量组对CYP3A1 mRNA的表达具有上调的趋势，但无统计学差异。高剂量组对CYP3A1 mRNA的表达具有显著上调作用（P<0.05），见图2。
3.2.3CYP2B1 mRNA与空白组相比，苯巴比妥组对CYP2B1 mRNA具有极显著的上调作用（P<0.01），低剂量组无明显变化，高剂量组有显著的上调作用（P<0.05），见图3。
3.2.4CYP2C11 mRNA与空白组相比，苯巴比妥上调的趋势，但无统计学差异。高剂量组有极显著的上调作用（P<0.01），见图5。
3.2.6CYP2E1 mRNA与空白组相比，苯巴比妥组对CYP2E1 mRNA有上调的趋势，但无统计学差异。低剂量和高剂量组有显著的上调作用（P<0.05），见图6。
4讨论
细胞色素CYP450又称混合功能氧化酶和单加氧酶<sup>[7]</sup>，属于一类亚铁血红素- 硫醇盐蛋白的超家族，是一种单链的B族细胞色素蛋白。在外源及内源物质的生物转化过程中，细胞色素CYP450发挥着至关重要的作用， 是肝脏中重要的药物代谢酶。CYP450酶活性/含量的改变直接影响了经其代谢的药物在体内的有效量和作用时间，与药效和用药安全性有密切的联系。了解药物对CYP450酶可能存在的诱导或抑制作用是药物研究过程中不可缺少的研究内容<sup>[8]</sup>。中药成分复杂， 由中药引起的代谢性药物相互作用，多数是由于中药影响细胞色素P450的活性或机体CYP450蛋白表达能力，致使机体对药物的处置特征改变，引发药物不良反应。体内涉及到大多数药物代谢的CYP450酶主要存在于肝微粒体中，其中参与药物代谢的主要CYP450是CYP3A4，CYP1A2，CYP2B6，CYP2D6，CYP2C9，CYP2C19，CYP2E1<sup>[9]</sup>。本实验考察了热毒宁注射液对大鼠肝脏内相对应的6种亚型CYP3A1，CYP1A2，CYP2B1，CYP2D2，CYP2C12，CYP2C13的酶活性及CYP1A2，CYP3A，CYP2B1，CYP2C11，CYP2D1，CYP2E1等酶亚型mRNA表达水平的影响。实验结果表明，热毒宁注射液在酶活性和mRNA水平对大鼠CYP3A1均具有显著的诱导作用，说明酶活性的上升很可能是由于转录水平的增强，进而增加了大鼠CYP3A1的mRNA翻译，间接促进了酶活性的上调。有研究表明，热毒宁注射液不良反应的发生与用药总量、合并用药等因素有关，在是否有合并用药因素中，抗微生物药、大环内酯类药物有非常显著性差异。据文献报道，大环内酯类抗生素在肝脏经CYP3A4代谢， 脱去氨基糖分子中叔胺基的N-甲基，代谢物再与CYP450分子中血红蛋白的亚铁形成亚硝基烷烃复合物而使药酶失去活性<sup>[10]</sup>。热毒宁注射液与大环内酯类抗生素合用时，热毒宁注射液可促进大鼠CYP3A1酶的活性，使大环内酯类抗生素代谢物增多，从而可能产生上述不良反应。这一结果为热毒宁注射液临床的联合安全用药提供了依据。另外，CYP3A1是含量最多的CYP450酶，占肝脏中P450酶总含量的30%～40%，临床上50%～60%的药物通过此亚型代谢而排除体外<sup>[11]</sup>，热毒宁注射液可诱导大鼠CYP3A1酶的活性，联合用药时要考虑其剂量范围。
联合用药引起药物之间的相互作用主要是诱导或抑制CYP450的结果，这种药物之间的相互作用是决定用药方案的重要因素。一般而言，酶抑制作用所致的代谢性相互作用的临床意义远大于酶促作用，约占该酶系统全部相互作用的70%<sup>[10]</sup>。CYP2B6，2C9，2C19，2D6参与了临床40%～50%的药物代谢。实验结果显示，热毒宁注射液对大鼠CYP2B1，2C12，2C13，2D2的酶活性均具有一定的抑制作用。与其他药物合用时，热毒宁注射液可能会使其他药物的代谢减慢，出现药物蓄积现象，进而可能发生药物相互作用或毒性的积累。因此，热毒宁注射液与其他药物联合用药时要充分考虑可能出现的药物相互作用或潜在风险。
热毒宁注射液是不可多得的抗病毒抗菌中药注射剂。热毒宁注射液作为中药注射液成分较复杂，临床与其他药物联合用药时可能会发生配伍变化。热毒宁注射液对大鼠CYP450酶的研究表明，其对CYP450酶的整体影响较小，这与其在临床上的不良反应发生率很低相符合。本实验通过研究热毒宁注射液对大鼠肝脏细胞色素CYP450酶酶活性和mRNA水平的影响，为热毒宁注射液的临床合理用药提供了依据。
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[责任编辑张宁宁]