【摘 要】 目的 检测I-TAC及其受体CXCR3在乳腺癌组织及癌旁正常乳腺组织中的表达差异，探讨I-TAC/CXCR3生物轴在乳腺癌发生、发展过程中的作用。方法 收集滨州医学院附属滨州市中心医院普外科经手术切除的40例乳腺癌组织作为实验组，同时收集相应的40例癌旁正常乳腺组织作为对照组。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫组织化学技术分别检测各组织I-TAC及CXCR3 在mRNA及蛋白水平的表达差异，并分析CXCR3的表达与乳腺癌常见临床病理参数的关系。结果 I-TAC及CXCR3在乳腺癌组织中mRNA水平和蛋白水平的表达均显著高于癌旁乳腺组织，差异分别均具有统计学意义（P<0.05）。临床病理参数分析提示，CXCR3的表达与乳腺癌组织分化程度及淋巴结转移呈正相关，而与乳腺癌患者的年龄、肿瘤分期及大小等无关。结论 乳腺癌组织中存在I-TAC及其受体CXCR3的过度表达，I-TAC/CXCR3信号传导通路可能在乳腺癌发生、发展过程可能扮演重要角色。
【关键词】趋化因子；I-TAC；CXCR3；乳腺癌。
Abstract Objective： To detect the expression of I-TAC and its receptor CXCR3 in brest carcinoma， and to explore the role of I-TAC/CXCR3 biological axis in the occurrence and development of breast cancer. Methods： 40 cases of breast cancer tissues from general surgery of Binzhou Central Hospital affiliated to Binzhou Medical College were collected as experimental group， and 40 cases of normal breast tissues adjacent to cancer were collected as control group. Reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） and immunohistochemistry were used to detect the expression of I-TAC and CXCR3 at mRNA and protein levels， respectively. Finally， the relationship between the expression of CXCR3 and common clinicopathological parameters of breast cancer was analyzed. Results： The expression of I-TAC and CXCR3 in breast cancer tissues was significantly higher than that in adjacent breast tissues （P < 0.05）. The expression of CXCR3 was positively correlated with histological differentiation and lymph node metastasis of breast cancer， but not with age， tumor stage and size of breast cancer patients. Conclusion： I-TAC and its receptor CXCR3 are overexpressed in breast cancer tissues， and I-TAC/CXCR3 signaling pathway may play an important role in the occurrence and development of breast cancer.
Key words Chemokines；I-TAC；CXCR3；Breast carcinoma.
【中圖分类号】R446.1 【文献标识码】A 【文章编号】1005-0019（2018）19-0-01
乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤之一，据2016年世界癌症组织发布的临床肿瘤资料显示全球范围内每年新发乳腺癌患者近200万，约占女性所有恶性肿瘤的四分之一，而每年因乳腺癌而死亡的患者超过60万人，约占女性恶性肿瘤死亡人数的20%[1]。在国内，乳腺癌自上世纪70年代末以来发病率一直呈逐年上升趋势，已发展为女性发病率第一的恶性肿瘤。2016年中国新发乳腺癌患者约20万人，高居女性恶性肿瘤发病率的首位，严重威胁女性健康。乳腺癌的预防和诊治已成为全世界面临的重大公共卫生问题[2]。尽管目前乳腺癌的基础研究与临床治疗均取得较大的进步，但仍有接近35%的早期乳腺癌患者发生肿瘤的远处浸润或切除术后复发[3]，导致乳腺癌患者的死亡率居高不下。趋化因子的主要作用是趋化细胞的迁移， 趋化因子通过与受体结合激活后，可引起肿瘤增殖、分化、侵袭及转移等信号通路的活化。目前证实趋化因子受体及其配体在多种恶性肿瘤如甲状腺癌、子宫内膜癌、胃癌及结直肠肿瘤等组织中均高表达。本文通过RT-PCR技术以及免疫组化技术分别检测趋化因子I-TAC及其受体CXCR3在乳腺癌组织中的表达水平，并初步揭示I-TAC/CXCR3信号通路在乳腺癌发生、发展过程中的作用。
1 材料与方法
病历资料及试剂： 所有乳腺癌患者临床及病理资料齐全，且术前均未进行过任何形式的抗肿瘤治疗。癌旁正常乳腺组织为距离肿瘤5 cm以外的正常乳腺组织，且病理切片未见肿瘤细胞。患者年龄33-72岁，平均年龄45岁。乳腺癌患者中有淋巴结转移29例、无转移11例。TNM 分期： I 期 11 例，Ⅱ期 20 例，Ⅲ期 9 例。组织学分级： I 级 5 例，Ⅱ级 17 例，Ⅲ级 18 例。鼠抗人CXCR3抗体（ab64714）购于abcam公司，兔抗人I-TAC单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司， CXCR3及I-TAC 抗体均采用1：200稀释，DAB显色、苏木素复染透明后中性树胶封片，显微镜下观察。PBS代替一抗做阴性对照。
1.2 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测 I-TAC 及 CXCR3 mRNA的表达：分别收集乳腺癌组织和癌旁正常乳腺组织，并用 Trizol 法提取总RNA。根据TaKaRa RT-PCR试剂盒说明书，进行cDNA合成和PCR扩增。引物根据Medline基因文库用Primer 5.0软件自行设计，目的基因I-TAC引物：上游：5’-CAAGGCTTCCCCATGTTCA-3’；下游：5’-CCCAGGGCGTATGCAAAGA-3’；产物长度为105 bp，退火温度为60℃。CXCR3引物：上游：5’-GCCCAAGAATAGATGCTGACTG-3’下游：5-TGAAAGGAGAAGAGCCTGAAGTG-3’；产物长度为165 bp，退火温度为56℃。内参β-actin的上游引物为：5-CAACGGCTCCGGCATGT-3’，下游引物为：5’-CCACACGCAGCTCATTGTAGAA-3’，预计扩增片段为257 bp，退火温度55℃。产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳、Bio-PAD凝胶成像系统分析电泳条带灰度值。目的条带mRNA表达相对强度=目的条带mRNA灰度值/β-actin条带灰度值。
1.3 免疫组织化学染色及结果判定：采用SP法，组织切片常规脱蜡至水洗；3%的过氧化氢处理10 min后，磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，每次5 min；滴加封闭液（10%山羊血清）15 min；加一抗37℃2 h（阴性对照用PBs代替一抗）；PBS洗3次，每次5 min；生物素标记二抗37℃15 min；PBS洗3次，每次5 min；过氧化物酶（HRP）标记链霉卵白素15 min；PBS洗3次，每次5 min；DAB显色3 min；水洗，苏木精复染、封固。随机选取10个视野，计算每个高倍视野（×400）下分别计数100个肿瘤细胞，计算阳性细胞数占细胞总数的百分比，取均值，并由两位有经验的病理医师分别双盲阅片，按肿瘤细胞阳性细胞率和着色强度分别进行记分。
1.4 统计学处理：所有数据均采用SPSS 17.0统计软件进行检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 I-TAC、CXCR3 mRNA水平的表达：I-TAC mRNA在乳腺癌组中相对表达量为0.76 ± 0.11，在癌旁正常乳腺组织中表达为0.39 ± 0.07，两者比较差异有统计学意义（P<0.01）。CXCR3在乳腺癌组织中mRNA水平的相对表达量为0.85±0.10，而在癌旁正常乳腺组织中表达为0.44±0.09，差异有统计学意义（P<0.05，表1）。
2.2 I-TAC、CXCR3 蛋白水平的表达：I-TAC在乳腺癌组有32例阳性表达，阳性率80.0%，而其在癌旁正常乳腺组有22例阳性表达，阳性率55.0%，两组比较差异有统计学意义（P<0.01）；乳腺癌组CXCR3表达阳性的27例，阳性率67.5%，而癌旁相应正常乳腺组织中CXCR3表达阳性有16例，阳性率40.0%。两组比较差异有统计学意义（P<0.05，见表2）。
2.3 CXCR3表达与乳腺癌常见临床病理参数的关系：CXCR3表达与乳腺癌患者组织分化程度及腋窝淋巴结转移有关（X2 = 8.391、5.277，P<0.05）。结果提示，肿瘤低分化组及淋巴结转移组乳腺癌患者CXCR3阳性表达率均分别高于肿瘤高分化组及淋巴结无转移组。CXCR3表达高低与乳腺癌患者年龄，病理分期以及肿瘤大小等无显著关系。
3 讨论
趋化因子受体CXCR3是一种G蛋白偶联受体，包括三种结构类似的特异性配体如干扰素γ诱生单核因子（MIG，又名CXCL9），干扰素γ诱导性肽10（又名CXCL10）以及干扰素诱导的T细胞α趋化因子（I-TAC，又名CXCL11）等，CXCR3与其配体结合后能诱导活化的效应细胞向特定组织迁移，参与机体免疫和肿瘤的发生、发展和转移[4]。多篇文献报道CXCR3在消化道系统肿瘤、血液系统肿瘤以及妇科肿瘤等多种不同肿瘤组织中表达活跃，基础研究也证实，趋化因子可能在肿瘤侵袭、转移过程中扮演重要角色，包括穿入血管、锚定、穿出血管、免疫逃逸以及血管生成等，CXCR3与肿瘤转移有关的可能机制是CXCR3高表达的恶性肿瘤细胞容易迁徙至表达其配体的特异性靶器官[5]。CXCR3在在结肠癌、胃癌和肝癌等肿瘤组织中阳性表达率较高，而在其相应癌旁组织或正常上皮组织中表达较弱或者不表达，且CXCR3的表达与病理分期、肿瘤组织分化或淋巴结转移等密切相关，此外，CXCR3强阳性的肿瘤患者预后一般较差[6]。文献亦有报道趋化因子受体CXCR3与其配体在肿瘤中的作用，如BAI[7]等报道结肠癌组织中CXCR3及CXCL10是表达显著上调的，且CXCR3的表达水平高低可以作为评估进展期结肠癌患者预后的重要指标。肾癌细胞可高表达趋化因子受体CXCR3，并通过与配体CXCLl0相互作用，介导肾癌细胞的远处转移和侵袭[8]。许超等[9]报道了CXCR3-CXCLl0生物轴在结直肠肿瘤中的作用，通过体外迁移实验发现CXCLl0对高表达CXCR3的结肠癌细胞SW620和HT29的趋化作用非常显著，而低表达CXCR3的结肠癌细胞SW480趋化作用不明显，这些结果初步提示体内CXCLl0对高表达CXCR3的肿瘤细胞具有一定趋化作用。目前I-TAC/ CXCR3在乳腺癌组织中的作用尚未见报道。我们通过运用RT-PCR法和免疫组织化学技术检测乳腺癌组织及癌旁正常乳腺组织中I-TAC及CXCR3的表达，发现乳腺癌组织中I-TAC及CXCR3无论mRNA水平还是蛋白水平的表达均显著高于癌旁正常乳腺组织。如CXCR3在乳腺癌组27例阳性表达，阳性率为67.5%；CXCR3在癌旁正常乳腺组织中16例阳性表达，阳性率为40.0%；I-TAC在乳腺癌组有32例陽性表达，阳性率80.0%，I-TAC在癌旁正常乳腺组织中有22例阳性表达，阳性率为55.0%。此外，临床病理参数分析提示CXCR3的表达与肿瘤组织分化及腋窝淋巴结转移等密切相关，证实I-TAC/ CXCR3生物轴在乳腺癌侵袭、转移过程中发挥一定的作用。
趋化因子受体及配体系统与肿瘤的关系具有双向性[10-11]。趋化因子受体及其配体网络调控受诸多因素的影响，故其与肿瘤发生、发展的关系还有待深入研究。但可以预见， 合理的应用趋化因子或其受体可有效地诱导、活化、趋化免疫效应细胞， 引导杀伤肿瘤细胞。因此，趋化因子相关的基因靶向治疗有望成为新的肿瘤治疗策略和手段。
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