[摘要] 目的 检测小鼠致病性大肠杆菌（enteropathogenic E. coli，EPEC）腹泻模型的外周血血浆中的辅助性T淋巴细胞1、2、17型（Th1、Th2、Th17淋巴细胞）代表因子，探索小鼠胃肠道感染时免疫反应的变化。 方法 普通健康昆明小鼠40只随机分成生理盐水对照组（20只）和实验组（20只）。实验组EPEC灌胃，建立小鼠感染性腹泻动物模型。对照组生理盐水灌胃。细菌灌胃后24 h取实验组和对照组外周血，离心后取血浆。采用流式液相多重蛋白定量技术（CBA技术）检测血浆中的白介素2（IL-2）、肿瘤坏死因子（TNF）、伽马干扰素（IFN-γ）、白介素6（IL-6）、白介素10（IL-10）、白介素4（IL-4）、白介素17A（IL-17A）淋巴细胞因子水平。 结果 实验组小鼠灌胃前白细胞（WBC）[7.10（5.825，8.625）×109]较灌胃后WBC[28.85（18.80，38.35）×109]差异有统计学意义（P < 0.05）；灌胃细菌24 h后外周血浆中IL-2[2.60（2.33，2.70）ng/L]、IL-6[5.65（3.93，28.35）ng/L]、IL-10[15.40（12.10，18.65）ng/L]、IL-4[2.95（2.70，3.30）ng/L]、IL-17A[2.85（2.53，3.48）ng/L]较对照组升高且差异有统计学意义（P < 0.05），TNF[11.85（9.38，12.65）ng/L]、IFN-γ[4.50（3.40，10.70）ng/L]细胞因子水平与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 EPEC感染小鼠后IL-2、IL-6、IL-10、IL-4、IL-17A淋巴细胞因子水平改变，Th1/Th2/Th17细胞参与此免疫反应，小鼠体内以Th2细胞介导的体液免疫为主，Th1细胞介导的免疫反应在小鼠模型的炎性反应过程中占非主导地位。
[关键词] 动物模型；腹泻；细菌感染；淋巴细胞因子
[中图分类号] R574.62 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）07（a）-0037-03
感染性疾病在儿童疾病谱中仍占首要位置，在胃肠道感染疾病中，EPEC在发展中国家儿童中的发病率较高[1-2]，尤其是3岁以下的幼儿，且疾病的危害性大。在儿童胃肠感染性疾病中，近年来有关轮状病毒性腹泻疾病中CD4+T淋巴细胞亚群及其代表因子的研究较多，细菌性腹泻病例散发、不易收集，国内外文献关于细菌性腹泻病例的CD4+ T淋巴细胞亚群代表因子研究少有报道。Th1、Th2、Th17淋巴细胞是CD4+T淋巴细胞的三个亚群，在感染性疾病和免疫相关等疾病中发挥着重要作用。本研究以小鼠细菌感染性腹泻为疾病模型，探索小鼠经口感染EPEC后外周血浆中的Th1、Th2、Th17淋巴细胞代表因子水平的变化以了解小鼠的免疫反应特点。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 普通健康昆明小鼠40只，雌雄各半，体重18～22 g（5～6周龄，购自军事医学科学院实验动物中心，检验检疫合格），于军事医学科学院实验动物中心屏障实验室进行实验。将40只昆明小鼠随机分成生理盐水对照组（20只）和实验组（20只）。
1.1.2 主要实验试剂与仪器 致病性大肠杆菌（EPEC-E2348/69）（军事医学科学院实验动物中心惠赠），小鼠T淋巴细胞因子CBA组合试剂盒（BD美国），血细胞分析仪（NIHON KOHDEN日本），离心机（德国KENDRO公司），-80℃冰箱，涡旋混匀器（IKA公司），流式细胞仪（美国BD公司）。
1.2 感染性腹泻小鼠模型制备
1.2.1 实验组 所有小鼠均单笼饲养，实验前禁食24 h、禁水1 h。①实验开始前对每只小鼠进行眼眶静脉采血，放置于经EDTA钾盐溶液浸润过的容器中，留作血细胞分析。②给每只小鼠灌胃3%碳酸氢钠溶液0.3 mL。③配制浓度为5×108 cfu/mL的致病性大肠杆菌混悬液，灌胃碳酸氢钠溶液半小时后，对实验组每只小鼠灌入细菌混悬液0.5 mL；4.8 h后更换空鼠笼，不添加垫料，观察小鼠的大便性状。
1.2.2 对照组 对照组不作血常规检测，处理因素将致病性大肠杆菌混悬液更换为生理盐水0.5 mL，余处理过程同实验组。
1.2.3 实验中观察及检测指标 ①灌胃8 h后，观察小鼠的大便性状、精神状态、行动动作。②灌胃后第24小时，对实验组所有小鼠采血进行血细胞分析。小鼠精神萎靡、少动或激惹躁动，大便性状为黏液、稀便，血细胞分析白细胞计数结果差异有统计意义则视为造模成功。
1.3 感染性腹泻小鼠外周血T淋巴细胞因子检测
1.3.1 外周血采集及血浆分离 在第24小时对实验组、对照组小鼠行摘眼球法取血，取部分血行血细胞分析，余下经过离心10 min（3000 r/min，离心半径16.5 cm），收集血浆，冻存于-80℃冰箱中以备统一检测。
1.3.2 T淋巴细胞因子检测 上述血浆在37℃孵化箱中解冻， 细胞因子检测具体步骤按试剂盒说明书进行，经过流式细胞仪上机处理后可获得各细胞因子的荧光强度值，通过标准曲线换算成相应浓度（自动换算），结果以ng/L表示。
1.4 统计学方法
采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，非正态分布及未知分布形态总体采用秩和检验Wilcoxon W检验，数据以M（P25，P75）中位数、四分位间距表示。以P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 感染性腹泻小鼠模型的建立
细菌灌胃后约6 h小鼠出现倦怠、精神萎靡、行动迟缓，部分小鼠出现黏液便、稀便，部分小鼠出现松软大便（较正常粪便含水多）。灌胃前后分别取小鼠血液进行血细胞分析，结果表明实验组小鼠灌胃前后白细胞计数（WBC）水平差异有统计学意义（P < 0.05），中性粒细胞百分比（N%）、淋巴细胞百分比（L%）虽有改变，但差异无统计学意义（P = 0.076 > 0.05，P = 0.086 > 0.05）。见表1。
2.2 血浆中Th1、Th2、Th17淋巴细胞因子水平检测
实验组小鼠在胃肠感染后外周血浆中淋巴细胞因子：IL-2、IL-6、IL-10、IL-4、IL-17A较对照组水平升高，与对照组比较有统计学差异（P < 0.05）。TNF、IFN-γ两细胞因子水平与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。
3 讨论
有关动物细菌性腹泻模型的报道较少，主要是大肠杆菌诱导动物腹泻模型，且多为经腹腔注射诱导动物腹泻，但此类方式与传统的人类经口感染方式不同。本实验采用经口灌喂细菌感染小鼠，与传统的运用中草药及腹腔注射制作小鼠腹泻模型原理不同，模仿人类胃肠感染主要诱发途径（经口感染）。通过主观的观察指标（大便性状、行动动作）和客观实验数据（血细胞分析结果）分析判定小鼠感染，更能模拟人类肠道感染时状态。本次实验开始前采取禁食水以及灌胃碳酸氢钠溶液，目的是为了减少肠内容物及营养物、减少胃酸分泌 ，降低胃肠的屏障功能使得细菌得以存活继而繁殖、黏附，造成肠道组织损伤及其免疫反应以达到腹泻的效果。人类细菌感染一般情况下白细胞计数是升高的，但实验过程中小鼠白细胞计数表现为降低（重复两次），或许是重度感染所致，中性粒细胞及淋巴细胞百分比变化符合人类细菌感染时情况但差异无统计学意义，具体有待进一步研究（但考虑为唯一处理因素，且处理后有统计意义，处理有效）。
细菌肠道感染后，鼠模型的肠黏膜完整性及上皮细胞受损、细菌毒素侵入及局部体液分泌使小鼠出现黏液稀便、精神萎靡等炎性反应的表现，血细胞的组成比例也发生变化。肠道黏膜免疫系统和全身的免疫系统产生应答，有多个细胞因子参与，其中包括Th1类淋巴细胞代表因子：IL-2、TNF、IFN-γ，Th2类淋巴细胞代表因子：IL-6、IL-10、IL-4，Th17类淋巴细胞代表因子：IL-17A，它们在适应性免疫应答过程中起着重要作用。
有研究指出儿童感染性腹泻病发病时体内IL-6水平升高[3-4]，包括细菌性和病毒性腹泻，本实验小鼠在细菌感染后血液中IL-6水平也呈升高趋势。IL-6是多功能炎症细胞因子，升高后可促进B细胞增殖分化和分泌抗体，促进抗体与抗原（病原）结合进而清除病原。
IL-2在T细胞介导的细胞免疫应答中起到促进、维持T细胞活化增殖的重要作用，促进所有亚型T淋巴细胞活化增殖及产生细胞因子。IL-4促使活化的B淋巴细胞分泌IgE和IgG1，促进IgG向IgE类型转换，以自分泌方式促进Th2细胞分化但抑制Th1细胞增殖及其应答等，在变态反应疾病发病过程中有重要作用。关于IL-2、IL-4这两个因子在感染性腹泻病（尤其是细菌性）中少有报道，在一项旅行者腹泻研究中[5]诺瓦克病毒感染组IL-2、IFN-γ升高，主要由Th1细胞介导免疫反应，诺瓦克病毒和产毒性大肠杆菌混合组呈现Th1/Th2双重免疫反应。本研究提示IL-2、IL-4都高于正常对照组，IL-2在疾病过程中促进了各亚型T细胞活化，促进炎症的发展，IL-4的升高一定程度上抑制了Th1介导的免疫反应，同时也促进了Th2介导的免疫反应。
IL-10是一类重要的抑制性细胞因子，抑制IL-2、IFN-γ等促炎细胞因子产生，抑制Th1细胞应答。IL-10作为抗炎介质对脓毒症有一定保护作用，Florquin等[6-7]报道BALB/C小鼠经注射葡萄球菌肠毒素（SEB）4 h后血液中IL-10水平明显高于对照组，IL-10单抗可将SEB攻击小鼠的死亡率提高30%，该作用可被IFN-γ抗体抑制，IL-10是黏膜免疫应答的重要调节因子。本实验提示EPEC肠道感染小鼠血中IL-10水平升高，与上述研究结果类似，对炎症的放大和扩散起到限制作用，避免了炎性连锁反应及无限扩大，具有抑制全身炎性反应综合征、脓毒症的发生发展的作用。
IL-17A主要由Th17淋巴细胞产生，是重要的促炎因子，诱导炎症因子和趋化因子释放，如IL-6、IL-8等，募集、活化中性粒细胞并抑制其凋亡。在儿童感染性腹泻病研究中[8-9]，IL-17A参与疾病的免疫反应，且在迁延性感染中IL-17A水平高于急性期组和正常对照组。本次实验小鼠急性期出现感染性腹泻后IL-17A水平与对照组相比升高且有明显统计学差异，与报道不完全相同。IL-17A在急性期促进炎症反应，使机体产生免疫应答，但若长期高于正常水平存在将导致机体的慢性炎症或相关免疫性疾病发生。动物实验显示[10]，Th17细胞在肠道慢性炎症的维持中发挥重要作用，中和IL-17A后模型小鼠肠道炎症明显减轻。
本研究显示EPEC肠道感染模型中外周血TNF、IFN-γ水平均有不同程度升高，但与对照组比较无统计学差异。IL-2、IL-6、IL-17、TNF、IFN-γ为促炎因子，IL-4、IL-10为抗炎因子，但多个因子同时具有抗炎和促炎两种作用。本研究显示在出现胃肠道感染后，小鼠体内炎性反应并非单纯的促炎或抗炎细胞因子水平升高，也不是表现为单纯Th1类细胞因子或单纯Th2类细胞因子水平升高，呈现Th1/Th2混合免疫状态。虽然Th1细胞因子有一定程度升高，但IL-4以及IL-6、IL-10的明显升高表明在急性期以Th2细胞介导的体液免疫应答占优势，Th1/Th2下降，失衡的Th1/Th2是否能恢复、何时恢复、如何恢复有待进一步研究。如果调高的Th2、Th17细胞因子水平持续存在，那么推测EPEC肠道感染存在诱导慢性免疫性疾病的可能。
促炎因子反应过强则造成机体组织损伤加重，抗炎因子反应过强则对机体抗病原体免疫反应产生一定程度抑制效应，这种抑制效应在一定程度上能够减少或避免组织更大的损伤，但同时可造成慢性迁延性感染及相关免疫疾病的发生。促炎反应、抗炎反应、Th1/Th2细胞介导的反应是一个动态平衡过程，一旦失衡将导致相关疾病的产生如慢性炎症或免疫相关疾病。多种免疫相关性疾病与感染相关，可由感染直接或间接诱发，本研究表明EPEC肠道感染小鼠模型体内Th2、Th17细胞相关性淋巴因子增高为主，Th1/Th2降低，提示肠道细菌感染可能与某些病原体呼吸道感染[11]（合胞病毒等）一样，有增加变应性疾病发生的倾向。有关于非致病性大肠杆菌（Nonpathogenic E. coli ATCC 25922）抑制小鼠气道过敏疾病动物模型体内的特异性IgE、IL-4的水平的报道，且呈时间和剂量依赖性[12]，但本研究使用的是致病性大肠杆菌和健康小鼠，结果和研究方式有所不同。鉴于Th2、Th17细胞在变态反应性疾病发病机制中的重要作用，儿童感染性腹泻病（细菌感染）与变态反应疾病是否有一定相关性尚需进一步深入研究。
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（收稿日期：2013-05-07 本文编辑：卫 轲）