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摘要：目的 观察痰瘀同治方对心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）大鼠核因子（NF）-κB通路及心肌自噬、凋亡的影响，探讨该方抗MI/RI作用机制。方法 40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、吡咯烷二硫代甲酸铵（PDTC）干预组及痰瘀同治组。可逆性冠脉左前降支结扎缺血30 min、再灌注2 h复制MI/RI模型。造模前，痰瘀同治组每日予痰瘀同治方水煎液灌胃，其他各组给予生理盐水灌胃，连续3周。RT-PCR检测各组大鼠心肌NF-κB、自噬基因Beclin-1表达，Western blot检测心肌促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2表达。结果 与假手术组比较，模型组大鼠心肌NF-κB、Beclin-1 mRNA及Bax蛋白表达均显著增强，且Bcl-2蛋白降低（均P<0.01）；与模型组比较，痰瘀同治组能抑制再灌注后NF-κB、Beclin-1 mRNA及Bax蛋白高表达（均P<0.01），且作用与PDTC干预组相当（P>0.05），痰瘀同治组能显著上调心肌Bcl-2表达，且作用优于PDTC干预组（P<0.01）。结论 痰瘀同治方通过抑制NF-κB活化，改善心肌细胞凋亡，抑制自噬而达到保护心肌的作用。
关键词：心肌缺血再灌注损伤；核因子-κB；自噬；凋亡；痰瘀同治方；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.12.010
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）12-0038-05
Effects of Tanyu Tongzhi Formula on NF-κB Pathway， Autophagy and Antiapoptosis of Rats with Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury TANG Dan-li1， CUI Hai-feng1， SUI Yu1， TONG Lin2， LIU Zhai-hua3， ZHANG Hua-min2 （1.Experimental Research Center of China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；2.Institute of Information on Chinese Medicine of China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；3.Institute of Basic Theory for Chinese Medicine of China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）
Abstract：Objective To observe the effects of Tanyu Tongzhi Formula （TYTZF） on NF-κB pathway， autophagy and antiapoptosis of rats with myocardial ischemia-reperfusion injury （MI/RI）；To investigate the mechanism of anti-MI/RI of TYTZF. Methods Forty SD rats were randomly divided into sham-operation group， model group， PDTC and TYTZF groups. The model of ischemia reperfusion of the myocardium was reproduced by ligation of left descending artery for 30 min and followed by releasing the ligation for 2 hours in rats. The TYTZF group was fed with TYTZF decoction for gavage， while the other groups were fed with normal saline for 3 weeks. The gene expression levels of NF-κB and Beclin-1 were determined with RT-PCR；the protein expressions of Bax and Bcl-2 were detected by Western blot. Results Compared with the sham-operation group， both the expressions of NF-κB and Beclin-1 mRNA and the protein expression of Bax significantly increased， while the protein expression of Bcl-2 decreased in the model group （P<0.01）. Compared with the model group， the TYTZF group down-regulated the expressions of NF-κB，
基金项目：国家自然科学基金（81202630、81373792）；中国中医科学院基本科研业务费自主选题项目（ZZ2014002）
通讯作者：张华敏，E-mail：zhanghm@mail.cintcm.ac.cn
Beclin-1 mRNA and Bax， and up-regulated protein expression of Bcl-2 （P<0.01）. TYTZF showed better effects on up-regulating the level of Bcl-2 than PDTC （P<0.01）. Conclusion TYTZF could play a role in the protection of the myocardium by inhibiting the activation of NF-κB， and preventing the occurrence of apoptosis and autophagy of myocardial cell.
Key words：myocardial ischemia-reperfusion injury；NF-κB；autophagy；apoptosis；Tanyu Tongzhi Formula；rats
心肌梗死治疗已经进入再灌注时代，以溶栓治疗和急诊经皮冠状动脉介入治疗（PCI）为代表的方法，虽能开通闭塞血管，挽救濒死心肌，但在减少急性心肌梗死面积的同时，由于冠状动脉的骤然开通与血流恢复，引起血管内皮细胞功能异常、激活炎症因子等，可导致心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）[1]。随着研究的深入，研究人员逐渐发现缺血再灌注时除引起心肌细胞的坏死和凋亡外，还可引发心肌细胞自噬现象。诸多研究表明，MI/RI过程中心肌自噬表达增强，并和凋亡之间存在紧密联系，如Bcl-2表达下调不仅可以诱发凋亡，而且可通过激活Beclin-1来激活自噬[2-4]。
核因子（NF）-κB是一种诱导性转录因子，广泛存在于各种细胞。NF-κB大量激活是导致MI/RI所致的心肌炎性反应、凋亡、坏死、心功能下降的重要原因[5]。NF-κB不仅能介导细胞死亡的2个经典通路——坏死和凋亡，还与自噬性死亡密切相关。虽然对于NF-κB和自噬之间究竟是激活还是抑制的关系现尚存有争议，但同时也为MI/RI机制研究提供了新的启示和切入点。课题组前期研究显示，痰瘀同治方能够通过抑制NF-κB信号通路减轻再灌注炎症反应，对MI/RI起到明显的保护作用[6-7]。那么，该方能否通过NF-κB途径影响再灌注后自噬及凋亡而减轻再灌注的损伤？本研究基于此思路，建立大鼠MI/RI模型，观察痰瘀同治方预处理对再灌注损伤后NF-κB、自噬、凋亡的影响，探讨其可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级8周龄SD雄性大鼠40只，体质量（200±20）g，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，许可证号SCXK-（军）2012-0004。实验期间饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所动物房，SPF级常规饲养。
1.2 药物、试剂与仪器
痰瘀同治方由瓜蒌15 g、薤白15 g、清半夏10 g、赤芍15 g、黄连5 g等组成，所有饮片由北京同仁堂（亳州）饮片有限责任公司提供。上药水煎加热浓缩至4.3 g/mL，4 ℃保存备用。药物剂量按70 kg成人每日1剂原方用量换算出大鼠每日用量。吡咯烷二硫代甲酸铵（PDTC），Sigma公司；辣根过氧化物酶标记二抗（HRP），Jackson Immuno Research Laboratories公司；Bax、Bcl-2抗体及Cell Signaling，Technology公司；超纯RNA提取试剂盒及HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司。动物呼吸机ALC-V8，上海奥尔科特公司；多道生理信号采集处理系统RM6240BD，成都仪器厂；GeneAmP 9600型普通PCR仪，美国应用生物公司；Power Pac Basic电泳仪，美国Bio-Rad公司；MK3酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific公司。
1.3 分组、造模与给药
采用随机数字表法将40只大鼠分为假手术组、模型组、PDTC干预组及痰瘀同治组。痰瘀同治组灌服中药煎液1 mL/（100 g·d），其余各组大鼠灌服生理盐水1 mL/（100 g·d），造模前连续给药3周；PDTC干预组于再灌注前10 min尾静脉注射20 mg/kg PDTC。
模型制备参照文献[8]方法并加以改进，大鼠术前12 h禁食，不禁水。20%乌拉坦0.5 mL/100 g腹腔注射麻醉后仰卧位固定四肢及头部。记录Ⅱ导心电图。颈部、胸前手术野备皮，切开气管，连接呼吸机（呼吸频率70次/min，吸呼比1∶2，潮气量9 mL/kg）。自左侧第3～4肋间剪开皮肤，钝性分离肌肉组织，打开胸腔，剪开心包膜，于左心耳与肺动脉圆锥之间找出冠状动脉左前降支，并以5-0号丝线结扎分支起点外约1～2 mm（在丝线与心肌间放一根聚乙烯小管），此时缺血心肌壁呈现发绀、膨出，同时记录心电图，以标准肢导联Ⅱ导联ST段弓背上抬、T波高耸显示心肌缺血形成。再灌注模型结扎30 min后松开，使缺血冠脉再灌注，关闭胸腔，再灌注120 min，心电图示ST段回落1/2以上，提示造模成功。结扎前心电图不正常，或未到观察终点而死亡及造模不成功者剔除。假手术组开胸后不结扎冠脉，仅在相应部位用针空穿1次即可。
1.4 标本制备
大鼠再灌注2 h后腹主动脉取血，之后迅速剪取心脏，预冷生理盐水冲洗，冰盘上切取部分左冠状动脉供血区的心肌组织，称重后即于液氮中迅速冰冻，置于-80 ℃保存备用。在实验过程中各组均有死亡，每组随机取6只备检。
1.5 指标检测
1.5.1 RT-PCR检测 用超纯RNA提取试剂盒提取组织样本中总RNA，以1%琼脂糖凝胶进行电泳，再用HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒将总RNA反转录成cDNA，进行PCR反应检测mRNA表达，引物序列见表1。反应条件为：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，59 ℃、60 s，共30个循环。应用GelPro3.2凝胶图像分析软件对各靶基因条带进行定量分析。
表1 RT-PCR引物序列
1.5.2 Western blot检测 取大鼠心肌组织标本100 mg剪碎，加入裂解液，经匀浆离心后，取上清液BCA法测定蛋白浓度。取各组样品30 μg，进行15%SDS- PAGE并电转移至PVDF膜上，5%BSA-TBST室温封闭1 h。根据抗体说明书以1∶1000用5%BSA-TBST稀释一抗，4 ℃冰箱中孵育过夜，用TBST洗涤，5 min×3次。然后，用5%BSA-TBST按1∶10 000比例稀释HRP二抗，室温下孵育40 min后，用TBST洗涤，5 min×3次。ECL反应3～5 min，胶片曝光10～300 s（曝光时间随不同光强度而调整），显影、定影、洗片。胶片扫描后进行图像分析，以β-actin作为内参照对比，比值结果表示其蛋白的相对含量。
1.6 统计学方法
采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组间均数比较采用方差分析，满足方差齐性时组间比较采用LSD法，不满足方差齐性时采用 Tamhane"s T2法进行两两比较，相关性分析采用Pearson检验方法。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 痰瘀同治方对再灌注后大鼠心肌核因子-κB基因表达的影响
与假手术组比较，模型组大鼠NF-κB mRNA表达显著增强（P<0.01）；与模型组比较，PDTC干预组及痰瘀同治组均能抑制NF-κB mRNA表达（P<0.01），且2组间比较无明显差异（P>0.05）。结果见图1。
2.2 痰瘀同治方对再灌注后大鼠心肌自噬基因Beclin-1 mRNA表达的影响
与假手术组比较，模型组大鼠Beclin-1 mRNA表达显著上调（P<0.01）；与模型组比较，PDTC干预组及痰瘀同治组Beclin-1 mRNA表达均下调（P<0.01）， 2组间比较无明显差异（P>0.05）。结果见图2。
NF-κB p65 162 bp
β-actin 150 bp
假手术组 模型组 PDTC干预组 痰瘀同治组
注：与假手术组比较，△△P<0.01；与模型组比较，**P<0.01；
与PDTC干预组比较，##P<0.01（下同）
图1 各组大鼠心肌NF-κB mRNA表达
Beclin-1 163 bp
β-actin 150 bp
假手术组 模型组 PDTC干预组 痰瘀同治组
图2 各组大鼠心肌Beclin-1 mRNA表达
2.3 痰瘀同治方对再灌注后大鼠心肌促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2表达的影响
与假手术组比较，模型组大鼠Bax表达显著上升、Bcl-2表达下降（均P<0.01）；与模型组比较，PDTC干预组及痰瘀同治组均能下调Bax表达并促进Bcl-2含量升高（均P<0.01），且痰瘀同治组上调Bcl-2表达作用强于PDTC干预组（P<0.01）。结果见图3。
Bax 20 kD
Bcl-2 26 kD
β-actin 43 kD
假手术组 模型组 PDTC干预组 痰瘀同治组
图3 各组大鼠心肌Bax、Bcl-2蛋白表达
3 讨论
NF-κB是与免疫球蛋白重链和к轻链基因增强子序列特异结合的核蛋白因子，是心脏应激反应快速表达基因，转录产生的细胞因子和黏附分子等能够直接引起血管内皮细胞和心肌细胞损伤，在心脏的MI/RI、心衰等病理变化中发挥关键性作用。NF-κB信号通路不仅是炎症反应的上游调节者，同时也能调节坏死、凋亡和自噬途径，与凋亡密切相关的Bcl-2、Bax也受到NF-κB的调节[9]。近期研究发现，NF-κB参与MI/RI诱发的自噬体形成，抑制NF-κB活性对于减轻MI/RI心肌细胞的自噬过表达及损伤具有保护作用[10]。 自噬是是一种广泛存在于真核细胞中的生命现象，是进化过程中高度保守的自我保护机制，MI/RI过程中自噬在心肌缺血中起保护性作用，但在再灌注阶段对心肌有害[11]。再灌注阶段，ATP等能量危机虽然缓解，但是其他促自噬机制如氧化应激、线粒体损伤等反应却可进一步激活自噬。Matsui等[12]通过实验证明MI/RI发生以后，大量生成活性氧，诱导Beclin-1基因的表达，细胞自噬水平明显增加。通过抑制Beclin-1的表达，可抑制细胞在再灌注阶段的自噬作用，减轻心肌自噬性细胞死亡程度。Beclin-1是自噬相关基因在哺乳动物中的同源基因，是细胞自噬发生的必需蛋白，能调控自噬体的形成和成熟[13]。而且，过度的自噬会导致自噬性细胞死亡，并常伴随细胞凋亡和细胞坏死的现象。自噬对于细胞的存亡取决于Beclin-1与Bcl-2之间的平衡[14]。Beclin-1的促自噬作用往往受到与其作用的Bcl-2的负性调节，灌注时Bcl-2/Bcl-XL结合蛋白如BNIP3的增加、Bcl-2的下降会加剧激活Beclinl诱导细胞凋亡和自噬。而升高的BNIP3本身也具有破坏线粒体完整性、增加超氧化物和促凋亡因子的作用。另外，自噬和凋亡之间通过共有通路，存在相互协作与相互制约的双重作用[15-16]。研究显示，自噬与凋亡之间存在交互作用调节因子，如E2F1、NF-κB等都在转录水平上发挥双重协调作用[17]。
本研究发现，再灌注后模型组NF-κB及Beclin-1 mRNA、Bax蛋白表达显著增强，同时Bcl-2蛋白表达明显降低（与假手术组比较，P<0.01），说明再灌注损伤可激活NF-κB，NF-κB转录启动促凋亡信号相关蛋白Bax等的表达，而某些促凋亡信号反作用于DNA，抑制Bcl-2的表达，进一步影响Beclin-1/ Bcl-2间平衡增强自噬反应，从而参与心肌自噬及心肌细胞凋亡过程。用NF-κB抑制剂PDTC进行干预后，模型组NF-κB及Beclin-1 mRNA、Bax蛋白表达减弱，而Bcl-2表达升高（与假手术组比较，P<0.01），说明抑制NF-κB的转录活性可以抑制自噬及凋亡反应，这一结果也得到了相关研究的支持[10]。实验结果显示，痰瘀同治方能抑制再灌注后NF-κB及Beclin-1 mRNA、Bax蛋白高表达，并促进Bcl-2含量升高（与模型组比较，P<0.01），且上调Bcl-2作用优于PDTC干预组（P<0.01），说明该方可能通过阻断NF-κB活化转录，改善心肌细胞凋亡，促进Bcl-2表达而抑制自噬相关基因Beclin-1激活而达到保护心肌的作用，而这一过程中NF-κB通过哪种具体机制对自噬及凋亡进行调控还有待于进一步研究。
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（收稿日期：2015-08-05）
（修回日期：2015-08-14；编辑：华强）