打开文本图片集
[摘 要] 目的：建立反相高效液相色谱法测定冻干粉针中DHEA含量。方法：采用Diamonsil C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈-水（55：45），流速1.0 mL · min- 1；检测波长206 nm；进样量20 μL ；柱温：室温。结果：在此色谱条件下DHEA与有关物质能达到较好分离，在0.01 mg · mL- 1～
0.7 mg · mL- 1浓度范围内与峰面积呈良好线性关系， r=0.9998；方法重复性RSD为0.42%；加样平均回收率（n=6）为98.91%。结论：该方法准确可靠，灵敏度高，专属性好，可用于测定DHEA冻干粉针含量。
[关键词] 高效液相色谱；冻干粉针；DHEA；类固醇激素
中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2015）05-071-03
[Abstract] Objective： To establish an RP-HPLC method for determination of the content of DHEA. Methods：Diamonsil C18 （250 mm× 4.6 mm，5 μm） column was adopted ； the mobile phase consisted of a mixture of acetonitrile - water （55：45） at the flow rate was 1.0 mL·min- 1 ；The ultraviolet detection wavelength was set at 206 nm； Loaded volume was 20 μL； the column temperature was room temperature. Results： DHEA and its related substances could be separated well. The linearity of DHEA was well correlated （ r=0.9998） within the range of 0.01 mg · mL- 1～0.7 mg · mL- 1. The method precision RSD was 0.42%. The average recoveries （n=6） was 98.91%. Conclusion： The method appeared to be accurate， reliable， sensitive， specific and can be used for the determination of the content of freeze-dried powder injection DHEA .
[Key words] HPLC；freeze-dried powder injection；DHEA； steroid hormone
引言
DHEA（脱氢表雄酮，dehydroepiandrosterone）为肾上腺及性腺分泌的一种类固醇激素，经大量研究发现，DHEA具抗衰老、预防心血管疾患、改善记忆、增强免疫力作用[1～2]，对小鼠的肝癌[3]、肺癌[4]、淋巴瘤[5] 等均有明显抑制作用；还能促进人类淋巴组织IL-2产生和释放，这正是HIV感染机体关键免疫步骤；此外，对糖尿病患者高血糖所致肾小球细胞损伤也有一定逆转作用[6]。人体试验表明，DHEA生理剂量未见明显毒副作用，但也有人对其大剂量服用带来潜在危害担忧，有试验表明[7-8]，过氧化酶体增生剂有致癌性，DHEA大剂量服用可引起肝细胞过氧化酶体增生，而低剂量无明显致过氧化酶体增生作用。因此，控制DHEA摄入量能合理有效降低其毒副作用。将DHEA做成冻干粉针注射剂，可降低给药剂量，提高生物利用度，而MATHII- AS LEBLANC等[9]研究DHEA在食蟹猴中药代动力学数据正好可以证实这一点。目前DHEA口服给药居多，DHEA冻干粉针剂是一种注射给药新剂型，本文建立简便、准确、可行、高效HPLC分析方法，用于测定冻干粉针中DHEA含量，为其质量可控奠定基础。
1 仪器与试药
仪器：Waters 2795高效液相色谱仪；2996二极管阵列检测器；Empower 数据处理系统； BP211D 型十万分之一天平；KQ3200型超声仪，UV-2501PC紫外分光光度仪。色谱柱Dikma， Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm），甲醇和乙腈均为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，甘露醇、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾均为优级纯（GR），吐温80（纯度99%）。DHEA对照品（含量：99.90%，军事医学科学院放射与辐射医学研究所自制）；DHEA冻干粉针（含主药10 mg/瓶）及空白辅料（军事医学科学院放射与辐射医学研究所自制）。
2 冻干粉针制备
按照DHEA：甘露醇：吐温80=（12：5：2）投料比，将处方量甘露醇和吐温80置研钵中，少量滴加配制好PBS缓冲液（pH=6.0） ，研匀后采用少量递加法加入已研细DHEA粉末，研磨均匀，加入PBS缓冲液，配制成每1 mL含有10 mg DHEA混悬液，再精密吸取1.0 mL置安瓿瓶中，在-40℃预冻后，抽真空并缓慢将温度升至0℃升华干燥，保持一段时间，直至含水量达1%以下，得疏松状固体后，封口即可。
3 溶液制备
3.1 对照品溶液制备
取DHEA对照品约10 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加适量乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。取对照品储备液2 mL至10 mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度摇匀，作为对照品溶液。
3.2 供试品溶液制备
称取供试品约14 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加适量乙腈超声5 min，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品储备液。 将供试品储备液用0.22 µm有机滤膜过滤， 精密吸取滤液2 mL至10mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度摇匀，作为供试品溶液。
3.3 空白溶液制备
精密称取与10 mg主药相当空白辅料，加乙腈超声5 min，并稀释至刻度，摇匀，过滤后取2 mL至10 mL量瓶中，加乙腈至刻度，摇匀，即可。
4 色谱条件与系统适用性试验
采用Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相：乙腈-水（55：45）；检测波长206 nm；流速1.0 mL·min- 1；进样量20 μL；柱温：室温。理论塔板数以DHEA算不低于5000。
按上述色谱条件，将对照品溶液、供试品溶液及空白辅料溶液分别进样，DHEA冻干粉针保留时间为10.06 min，空白辅料在此处无色谱峰出现，说明辅料对DHEA检测无影响。色谱图见图1。
5 方法学验证[10]
5.1 线性与范围
取对照品适量，配制成1.0 mg· mL- 1 对照品储备液，分别精密吸取0.1 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL置10 mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度摇匀，得一系列浓度标准溶液。取20 μL进样测定，记录色谱图。以峰面积A对浓度C（mg· mL- 1）进行线性回归，得回归方程 A=1.0×107C+3.4×104，（n=6）（ r= 0.9998 ），结果表明，DHEA冻干粉针在0.01 mg· mL- 1～0.7 mg· mL- 1浓度范围内与峰面积呈良好线性关系。
5.2 检测限、定量限
精密称取对照品适量，加乙腈超声溶解并稀释成一系列浓度进样，记录色谱图，在信噪比S/N=3时测得检测限为10 ng，在信噪比S/N=10时测得定量限为51 ng。
5.3 仪器精密度试验
取浓度为0.2 mg· mL- 1对照品溶液，连续进样6次，每次20μL，以峰面积计算，所得RSD为1.1%，表明仪器精密度良好。
5.4 重复性试验
取DHEA冻干粉针供10瓶，精密称定其装量，将倾出内容物混匀后，分别精密称取供试品9份，配制成低、中、高三种浓度，照“4”项下色谱条件测定，按外标法以峰面积计算得平均标示量（%）为98.67%，RSD为0.42%。
5.5 稳定性考察
取供试品适量， 配制成0.1 mg· mL- 1、0.2 mg· mL- 1、0.3 mg· mL- 1 3种浓度，于配制后0h、2h、4h、6h、8h、10h、24h、48h、72h各取20 μL进样，照“3”项下色谱条件测定峰面积，结果24h内3种浓度峰面积RSD分别为1.87%、0.38%、1.03%，72 h 3种浓度峰面积RSD分别为1.49%、1.02%、1.50%，表明供试品溶液放置3天稳定，能够满足测定要求。
5.6 加样回收测定
精密称取供试品适量，6份，分别精密加入对照品适量，加适量乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取2.0 mL至10 mL量瓶中加乙腈配制成含DHEA约0.2 mg· mL- 1加样溶液，摇匀，过滤后进样20 μL，测定回收率，结果（见表1）DHEA冻干粉针平均回收率为98.91%，RSD=0.43%。说明用本法测定DHEA冻干粉针含量准确度良好。
6 讨论
配制一定浓度对照品溶液，在190～800 nm范围内进行全扫描（见图2），可以看出本品为末端吸收，选择206 nm作为检测波长，既保证主药能有相应吸光值，又尽量远离溶剂截止波长。对于流动相，我们比较了甲醇-水系统和乙腈-水系统，均能有很好分离，但乙腈截止波长为190 nm，相对来说比甲醇干扰更小，故选用乙腈-水系统作为流动相。冻干粉针中主药DHEA不溶于水，可溶于有机溶剂，但辅料为水溶性，采用纯有机溶剂提取，这就大大减少了辅料对其干扰，由液相色谱图也可以进一步验证，空白辅料对测定无干扰。
冻干粉针剂相对于水针剂质量更稳定，也更适合于给药剂量较小药物。DHEA为类固醇激素，给药剂量小，对多种疾病均有较好治疗作用，制成冻干粉针剂，不仅可以提高生物利用度，也可以相对降低潜在毒副作用，进一步增加了药物给药方式选择途径。
参 考 文 献
[1] T， Ishizuka； K， Kajita； A， Miura，et al. DHEA improves glucose uptake via activations of protein kinase C and phosphatidylinositol 3-kinase[J].Am J Physiol.1999，276（1，pt.l）E196-204.
[2] Bednarek.Tupikowska G，Gosk I，Szuba A，et al .Influence of dehydroepiandrosterone on platelet aggregation，superoxide dismutase activity and serum lipid peroxide concentrations in rabbits with induced hypercholestemlemia [J].Med Sci Monit，2000，6 （1）：40-45.
[3] 吴红英，王月英，李德冠，等.E838联合γ射线对小鼠肝癌 H22 抑瘤作用研究 [J]，中国辐射卫生，2008，17（4）：387 - 389.
[4] 王月英，王小春，吴红英，等 .17a-D -高炔雌二醇-3-乙酯联合γ射线照射对不同品系小鼠抑瘤 作用[J].国际放射医学核医学杂志，2012，36（2）：95-98.
[5] 王月英，李德冠，吴红英，等.E838及其联合放化疗对IRM-2 小鼠自发淋巴瘤抑制作用 [J].中国生化药物杂志，2010，31（3）：29- 32.
[6] Brignardelo E，Gallo M，Aragno M，et al. Dehydroepiandrosterone prevents lipid peroxi-dation and cell growth inhibition induced by high glucose concentration in cultured rat mesangial cells[J].J Endocrinol，2000，166（2）：401-406.
[7] RAO M S，MUSUNURI S，REDDY J K. Dehydroepiandros-terone-induced peroxisome proliferation in the rat liver.[J].Pathobiology，1992，60（2）：82-86.
[8] Fumihiko Hayashi Tamura，Tunji Yamada. Characteristic of the hepato carcinogenesis caused by dehydroepiandrosterone，a peroxisome proliferater，in male F-344 rats[J]. Carcinegenesis.1994，15（10）：2215-2219.
[9] MATHIAS LEBLANC，CLAUDE LABRIE，ALAIN BELANGER，et al. Bioavailability and Pharmacokinetics of Dehydroepiandrosterone in the cynomolgus monkeys[J]. The Journal of Clinical Endocrinology &Metabolism.2003，88（9）：4293-4302.
[10] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典（二部）.北京： 中国医药科技出版社，2010： 附录194-195.