3月14日，正是草长莺飞、迎春花粲然报春之时。
在这大好春光中，业界专家学者云集于北京大学英杰交流中心，参加第六届中国眼科学基础研究大会暨研究生导师论坛。中国工程院院士、山东省眼科研究所所长谢立信教授在开幕发言中指出了眼表重建领域应用基础研究的发展方向。
眼表重建在中国：高难度挑战没商量？
眼表（ocular surface）包括结膜上皮、角膜上皮及泪膜。眼表涉及的解剖部位除了角膜和结膜外，还有眼睑和泪腺组织。临床上，眼表疾病（ocular surface disease，OSD）主要是指角膜上皮和结膜上皮的病变。角膜上皮的完整是维持角膜正常功能和视觉质量的关键，其稳定性受益于角膜缘基底部干细胞不断地增殖分化和向心性移动。当各种因素导致角膜缘干细胞的破坏，会引起角膜缘干细胞的衰竭。
谢立信院士认为，眼表疾病是眼科界面临的棘手疾病之一，其中角膜缘干细胞缺乏是引起众多眼表疾病的主要原因之一。角膜缘干细胞缺乏常会引起角膜上皮缺损、角膜新生血管、角膜结膜化、角膜溃疡甚至自溶，严重者还会引起睑球粘连、结膜囊闭锁，不但影响外观，有的甚至会引起失明。近年来，由于角膜缘干细胞理论和组织工程技术的完善和发展，眼表疾病的治疗也有了较大进展。目前眼表重建手术是治疗眼表疾病的重要手段，而干细胞移植则是眼表重建手术中的关键，包括自体或同种异体角膜缘干细胞移植、体外培养角膜缘干细胞移植以及口腔黏膜上皮细胞的培养移植。
迄今为止，《新英格兰医学杂志》共报道了3篇对眼表重建研究领域十分重要的论文，都是关于干细胞移植重建眼表的临床研究。2000年，知名眼表疾病专家、台湾蔡瑞芳医师在《新英格兰医学杂志》发表文章，采用羊膜为载体构建培养的自体重组角膜上皮膜片，对6例单侧角膜缘干细胞缺乏患者进行了移植治疗，术后5例视力明显提高。2004年，日本大阪大学眼科学系主任Kohji Nishida教授等改变了载体，用温敏材料载体构建培养的自体重组口腔黏膜上皮膜片，对4例双侧角膜缘干细胞缺乏患者进行了移植治疗，
术后眼表稳定、角膜透明性和视力都有所改善。2010年，意大利Pellegrini教授在细胞培养的载体方面又进行了改进，把载体换成了纤维蛋白胶，构建了自体重组角膜上皮膜片，完成了112例角膜缘干细胞缺乏症患者的移植治疗，其中76.6%的患者角膜恢复了透明，平均随访2.91年，其中最长的为5年，部分病例是先改善眼表功能，然后再进行穿透角膜移植手术恢复视力。
从目前的报道来看，培养的干细胞移植成功率多在75%左右，但决定成功率的关键是培养的重组上皮膜片中含有一定比例的干细胞，阻挡了新生血管向角膜的生长。在此情况下再做穿透角膜移植术，成功率就会较高。而且，他们选取的病例损伤程度较轻，基本都局限在角膜部位，结膜和其他眼表功能相对正常，没有明显的角膜基质和角膜内皮损害，血管膜切除方便；此外，多采用患者自体角膜缘干细胞移植，涉及到的免疫排斥反应问题也比较少。
“国内几个中心开展的眼表重建手术大多是参考国外的最先进技术，但我国眼表重建手术面临的临床科学问题与发达国家明显不同。患者病情复杂，不但有角膜缘干细胞的缺乏，且结膜和眼睑都有不同程度的损伤，必须先重建结膜囊，恢复眼表的功能，再进行角膜功能重建，板层角膜移植或穿透角膜移植手术进行复明；此外，患者多为双眼烧伤，没有自体角膜缘干细胞可用，这就要求我们用细胞生物学、分子生物学和免疫学的基础研究来解决这些临床问题。
既然临床上需要大的细胞膜片才能重建结膜囊，那么干细胞的体外大量扩增就成为了关键问题。有人说，这个细胞膜片可来自患者自体口腔黏膜，但重建结膜囊采用培养的口腔粘膜移植后近期效果很好，2年后，仍有新生血管长入，因为此类培养的上皮组织缺少抗新生血管的因子。这就需要改进干细胞培养的方法，当然目前也有很多细胞生物学和分子生物学的方法，但效率还比较低。我们科研团队的研究人员采用羊膜作为载体，探索通过加入一种称为“Rho蛋白激酶抑制剂”的小分子化合物Y-27632，来实现角膜缘干细胞的大量扩增，构建重组角膜上皮膜片，发现其中干细胞的数量和比例均明显增加。
角膜缘干细胞扩增，要突破更要安全
谢立信院士还介绍说，我们科研团队扩增培养构建出角膜缘上皮细胞膜片后，首先考虑的不是马上应用于临床，而要想到其在临床应用上的安全性。此前，我们已取得卫生行政部门的临床应用批件，可开展组织工程化角结膜上皮移植治疗技术临床应用。
目前小分子化合物Y-27632的分子机制明确，已有不少临床应用的报道证实其使用是安全的，但我们发现其主要功能是提高干细胞的抗氧化能力。既然要移植大的细胞膜片，就要尽量提高其存活能力，使其能在患者眼表很好地存活。首先，我们尽量采用比较成熟的角膜上皮膜片的制备方法和技术，也在很多方面做了改进，羊膜复合角膜缘干细胞膜片的制备方法已获得国家发明专利。
第二个重点是，经扩增后，上皮细胞膜片里的干细胞数量是否减少，所占比例是否会下降？我们发现，经过Y-27632扩增培养构建的角膜上皮细胞膜片，保持了原代角膜缘干细胞的正常比例，并略有增加。
另外，我们还要观察，经过扩增培养构建的将投入临床应用的角膜上皮膜片，是否具有正常角膜上皮细胞的解剖结构和生理特征。对此我们也做了对照研究，发现构建的重组角膜上皮膜片具有与正常角膜上皮类似的结构和功能特征。
最后，我们还要到临床上去验证重组角膜上皮膜片的治疗效果，结果发现，这些重组的角膜上皮膜片用于重建患者结膜囊的临床效果非常好，而且对于非常严重的患者，我们还可以进行二次移植，多数患者在一到两次移植后都恢复了较为正常的眼表功能，患者的满意度很高，因为如此严重的疾病目前在其他地方都没有办法解决。
培养的角膜缘上皮干细胞临床应用效果
一次移植
二次移植
眼表重建的机制假说，新谜团待解
谢立信院士说，我们在进行二次干细胞移植或进行穿透角膜移植术时，可以获得一个病变的血管膜或角膜组织，使用取下的病变组织做进一步的DNA基因分型和干细胞的病理检测，结合临床随访、术中印迹细胞学检查，结果发现： 移植后3～60个月，19例角膜组织印迹细胞学检查和印迹组织和5例受体角膜组织均未检测到供体DNA，全为受体表型。
这些移植的供体干细胞都去了何处？这给我们又设了一个新的谜团。一些病例3个月内供体DNA是表达的，还有一些病例在3个月至半年、甚至更长时间也有表达，但在一年后基本都找不到供体DNA的表达，都变成了受体自身的表型。
为解释供体干细胞消失的原因，我们团队的研究人员提出了三个新的假说：
第一种假说是，干细胞可能来源于受体的骨髓间充质干细胞；也就是说骨髓间充质干细胞受到刺激后，归巢到角膜组织。此外，我们观察到植片移植后干细胞的情况，发现眼表环境改善后，归巢到角膜组织的骨髓间充质细胞明显增多。
第二种假说是，这一现象是由于受体角膜缘干细胞复苏而造成。也就是说，自体角膜缘干细胞未完全死亡，只是由于病变的环境使之处于潜伏状态。当干细胞移植使病情缓解或微环境改善后，有一部分的自体角膜缘干细胞即行复苏。
第三种假说是，由于是重建结膜囊，残存的结膜部位仍有干细胞，移植的羊膜载体的角膜上皮膜片为残存的结膜干细胞提供合适的微环境和移行的支架。为验证第一种假说，我们进行了小鼠眼部化学伤后骨髓间充质干细胞归巢到角膜组织的检测及影响因素分析的实验研究。我们设计建立了动物模型，进行骨髓功能正常组、骨髓功能动员组和球结膜下注射组三组对照实验，试图分析小鼠眼部化学伤后骨髓间充质干细胞归巢到角膜组织的影响因素。实验结果显示，骨髓间充质干细胞有一定的“归巢效应”，眼表微环境改善后，归巢到角膜组织的骨髓间充质干细胞明显增多，并有利于眼表向角膜上皮表型分化，应用粒细胞集落刺激因子进行骨髓动员可以提高归巢效率；经骨髓动员或球结膜下注射的骨髓间充质干细胞均聚集在角膜缘处，不向角膜中央发生移动。但这是不是移植角膜缘干细胞消失的主要原因？我们分析，通过血液到达角膜缘的干细胞数量非常少，这一想法还有待其他研究来证实。
谢立信院士还指出，由于移植的角膜缘上皮干细胞细胞是来源于同种异体，术后常会面临免疫排斥反应问题，其主要临床特征是睫状充血、角膜周边部可见环状上皮排斥线及上皮缺损区，角膜缘处大量新生血管充盈、怒张，临床诊断并不困难。我们统计免疫排斥反应的发生率为23.3%。此外，通过临床共聚焦显微镜检查，我们发现在角膜缘和角膜上皮缺损部位可见大量朗格汉斯（Langhans）细胞浸润；还可以通过免疫印迹细胞学检查，观察到角膜周边和中央CD4、CD8阳性细胞的表达；经抗免疫排斥反应药物（糖皮质激素、环孢素A）治疗有效，眼表稳定。我们总结的角膜缘上皮干细胞移植术后免疫排斥反应病例的文章发表在2013年第5期的Ophthalmology杂志上。
对于眼表重建手术，我们还需要知道的更多，有很多问题要弄清楚，比如干细胞的临床应用标准的制定，这是基础向临床转化的关键；其次要研究移植后干细胞的去向和新的干细胞来源；以及随访了解移植角膜缘干细胞的功能究竟是短期还是长期的等诸多问题。这些科学问题都需要我们开展大量的临床和基础工作以进一步研究论证。
如何进行高效的科研？
针对怎样创造科研高效率的问题，谢院士表示，要先在临床上把科学问题提出来，然后在实验室进行应用基础研究，有了应用基础研究结果，再与临床问题结合，进行验证和总结后，投到比较有影响力的学术刊物上。也就是说，首先要善于发现临床医学中的科学问题，然后组织科研团队进行有目的的集中研究，发现科学证据后，再迅速向临床转化，同时要重视转化后的临床效果、评价及推广。
我们团队目前参与了一项973计划，里面有一只很大的“拦路虎”，就是关于同种异体来源的干细胞移植安全和标准的问题。我国相关部门对此研究的审批过程非常严格，难度很大。如果应用自体的干细胞移植较为容易，用自体口腔黏膜可以重建结膜囊，但要重建结膜上皮，恢复眼表的功能还需解决很多问题。而且，如果我们只能使用患者很少的一点自体干细胞进行扩增，就必须要有工程化技术手段来解决，因此需要细胞生物学专家帮助我们解决这个问题。要把临床应用再次出现的问题逐一解决，这就带来了很多后续研究，而这些研究不仅需要国家自然科学基金，还需要国家973等大项目的支持。
北京同仁医院王宁利教授表示，现在学术界注重的是看成果对本行业发展的引领作用，谢院士的文章都是在Ophthalmology、Iovs、Ajo等眼科顶尖杂志发表，其中有的是作为封面文章发表。临床问题驱动型科研是当前很重要的研究方式。我们呼唤“在思考中开刀，在开刀中思考”的医生。
谢立信院士就是从临床问题提练出科学问题，从科学问题、技术问题，找出假说再去验证。如果我们从角膜缘残留的细胞中找出干细胞，让它去扩增成为移植的来源，这可能是最理想的干细胞获取方式。但对于完全没有自体干细胞的患者来说，如何获得干细胞是眼科人亟需解决的问题。这个问题已超越眼科，成为一个大科学问题，需要统筹安排。