摘要：在我国，副溶血性弧菌被认为是海产品衍生疾病的主要因素，因此急需一种能快速、灵敏、特异、准确地检测食品中副溶血性弧菌的方法。传统培养法一直是检测的金标准，但是其检测周期较长;分子生物学方法如聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量PCR（qPCR）、环介导等温扩增技术（LAMP）已被广泛用于食品中副溶血性弧菌的检测，但是这些方法不能区分死菌和活菌的DNA，容易造成假阳性。而叠氮溴化丙锭（propidium monoazide，简称PMA）等核酸染料的使用可以有效地消除这一弊端。研究者们将PMA处理与PCR（qPCR）结合，应用于食品中多种食源性致病菌活菌的检测，但是关于PMA在副溶血性弧菌检测中应用的报道并不多见。因此，拟对PMA应用于食品中副溶血性弧菌检测的可行性进行分析，以便为进一步开展相关研究提供参考。
关键词：副溶血性弧菌;活菌检测;食源性病原菌;叠氮溴化丙锭（PMA）
中图分类号： TS207.4 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2019）04-0162-06
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，简称VP）是导致胃肠道感染的主要致病菌，广泛存在于海水、沉积物和各类海鲜（包括牡蛎、蛤蜊、扇贝、章鱼、虾、蟹、龙虾、克氏原螯虾和众多鱼类）中[1]。VP感染可引起腹泻、呕吐、腹部痉挛，在少数情况下可引起发烧[2]，但并不是所有的副溶血性弧菌都具有致病性。该菌的致病性与耐热直接溶血素（TDH）和耐热相关溶血素（TRH）相关，分别由tdh、trh基因编码[3-5]。此外，VP的主要毒力因子还有不耐热溶血毒素（TLH）。研究表明，TLH是一种非典型的磷脂酶，能溶解人和马的红细胞，具有副溶血性弧菌种属的特异性。TDH能在我妻氏血平板上引起β-溶血（神奈川现象），具有致死毒性、心脏毒性、细胞毒性和肠毒素作用;TRH虽然不能引起神奈川现象，但其与TDH有相似的免疫原性和67%的相同氨基酸序列，并同样具有致死作用和细胞毒性。我国食源性疾病监测网站相关工作人员调查了其监测地区（16个省）14年间的8 000多起食物中毒案例，发现微生物性病原仍然是我国食源性疾病的主要病因（占30%～40%）。近10年来，由交叉污染导致肉类食品或水产品（包括淡水鱼污染）而引起的副溶血性弧菌食物中毒已取代沙门氏菌，跃居第1位[6]。因此，迫切需求一种快速、简便、准确、实用的检测方法对副溶血性弧菌进行实时监控。
用传统培养法检测食品中的副溶血性弧菌一般需要经历增菌、选择性平板培养、生化鉴定等过程，检测周期长达5～7 d。而对副溶血性弧菌的定量检测，在对样品中的病原菌做定量分析后还需要对可疑菌落做定性验证，使得检测周期更长[7-10]。分子生物学方法，如实时荧光定量PCR（qPCR）具有快速、检测灵敏度高的优点，但是这类检测技术无法区分死菌和活菌，因为细菌DNA在菌体死亡后还能留存几天到几周。因此，使用该检测技术用于副溶血性弧菌的定性检测可能导致假阳性，若用于定量检测则无法得到准确的数据[11-12]。 叠氮溴化丙锭（PMA）是一种核酸染料，可用于PCR（qPCR），有效排除死菌DNA的干扰，达到特异性检测活菌的效果[12]。目前，众多学者已将PMA处理同qPCR结合应用于各种活菌检测，包括单增李斯特杆菌[13]、大肠杆菌 O157 ∶ H7[14]、弯曲菌[15]、金黄色葡萄球菌[16]、沙门氏菌[17]等。然而，将上述方法用于副溶血性弧菌检测的研究尚不多见。因此，本研究仅探讨PMA在副溶血性弧菌检测中应用的必要性和可行性，以期为副溶血性弧菌快速检测技术的研究提供新的思路。
1 副溶血性弧菌检测技术概述
1.1 传统培养法
GB 4789.7—2013《食品卫生学检验 副溶血性弧菌检验》中阐述了对副溶血性弧菌检测的传统培养方法。该方法包括增菌培养、选择性平板培养、生化鉴定、血清学反应等过程，整个过程耗时5～7 d。传统培养法可以得到活的病原菌，为检测结果的判定提供了切实有力的证据，一直是食品检测的金标准。但是其耗时长，操作繁琐，给实际检测工作造成了诸多不便;在市场经济高速发展的今天，超长的检测周期也影响了食品贸易的发展;而传统培养法对检测人员的要求也相对较高，可疑菌落的挑选决定了检测结果的准确度，在实际检测中容易出现人为因素而导致的假阳性或假阴性。
1.2 分子生物学检测法
应用于副溶血性弧菌检测的分子生物学检测方法主要包括聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光定量PCR（qPCR）、环介导等温扩增技术（LAMP）、变性高效液相色谱检测技术（DHPLC）、基因芯片技术等。PCR技术有操作简单、成本低、用时短等特点，已被广泛用于副溶血性弧菌的检测[6]，但在灵敏度和多基因检测方面有一定的局限性。除普通PCR外，多重PCR（MPCR）和巢式PCR也被广泛应用于副溶血性弧菌的检测中，它们在一定程度上优化了普通PCR，在缩短检测时间的同时可增强PCR的灵敏度和特异性。qPCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，通过检测聚合酶链式反应中产生的荧光信号来实现对VP的定性或定量检测。与PCR相比，qPCR不需要电泳确认，大大提高了检测效率，同时该方法在灵敏度、特异性、重复性等方面也更具有优势。qPCR可分为染料法和探针法，其中探针法通过探针可以增强反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号，能够用多重体系反应的方法，能够预测和提前进行反应条件的优化，缺点是要合成探针，成本高;染料法经济实惠，可以作溶解曲线，分析全部PCR产物的Tm值，缺点就是特异性相对于探针法较差。LAMP是在PCR的基础上发展起来的，相比于PCR方法，其操作流程更為简单，灵敏度更高，整个检测过程仅需15～30 min，且结果也不需要电泳等途径判定，凭肉眼观察颜色即可[18]。但是其颜色也经常介于阳性和阴性之间，会导致假阳性、假阴性或无法判断[19]。DHPLC常用于分子分型和流行病学研究，但也可用于致病菌的检测。Zhan等利用PCR-DHPLC技术建立副溶血性弧菌特异基因检测平台，可以通过洗脱峰快速判断结果[20]。该方法能有效避免PCR产物电泳检测的后污染，也使检测成本明显降低，具有简便快捷、高通量和自动化的特点，且其准确性和灵敏度高，重复性好，特别适用于大样本量的快速检测。除了上述检测手段外，基因芯片技术也被应用于副溶血性弧菌的检测中。基因芯片可以同时高通量检测多株副溶血性弧菌的多个基因及基因表达、SNP突变和缺失，具有很好的特异性和检测灵敏度，适用于副溶血性弧菌的系统化研究。目前，已有商品化的副溶血性弧菌基因芯片出售。但是基因芯片成本过高，需要特殊的设备，且检测流程复杂，并未得到广泛使用。