摘要目的：探究发酵虫草菌粉多糖的免疫活性。方法：发酵虫草菌粉通过水提醇沉、复溶、透析、浓缩、冷冻干燥得多糖，命名为CSMP60，其提取条件：60 ℃水提、提取时间4 h、料液比1∶15、提取次数2次。以小鼠免疫细胞为材料，检测CSMP60的免疫活性。结果：CSMP60能促进脾细胞的增殖（P<005），明显促进小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNFα（P<005），有促进脾淋巴细胞分泌IFNγ的趋势。结论：CSMP60可能是发酵虫草菌粉产生免疫活性的效应物质之一。
关键词发酵虫草菌粉；多糖；细胞增殖；脾细胞；巨噬细胞；免疫活性；肿瘤坏死因子；γ干扰素
Experimental Study on Immune Activities of Polysaccharides from Fermented Cordycepssinensis Powders
Jiang Hongliang1，Zhao Xiunan2，Ma Hao2，He Lifang3，Shan Junjie2，Wang Hainan1，4
（1 School of Pharmaceutical Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025，China； 2 Institute of Military Medicine，Academy of Military Sciences，Beijing 100850，China； 3 Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China； 4 China Food and Drug Administration，Beijing 100053，China）
AbstractObjective：To investigate the immunological activity of polysaccharides from fermented Cordycepssinensis powders.Methods：Polysaccharides from fermented Cordycepssinensis powders were obtained through water extraction and alcohol precipitation，reconstitution，dialysis，concentration and freezedrying，named after CSMP60.Its extraction conditions：60 ℃ water extraction，extraction time 4h，solidliquid ratio 1∶15，the number of extractions 2 times.The immune activity of CSMP60 was measured using mouse immune cells.Results：CSMP60 could promote the proliferation of spleen cells （P<005），and significantly promote the secretion of TNFα from mouse peritoneal macrophages （P<005）.It has a tendency to promote the secretion of IFNγ by spleen cells.Conclusion：CSMP60 may be one of the immunocompetence substances of fermented Cordycepssinensis powders.
Key WordsFermented Cordycepssinensis powders； Polysaccharides； Cell proliferation； Spleen cells； Macrophages； Immune activity； TNFα； IFNγ
中图分类号：R2855文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.08.050
发酵虫草菌粉是我国学者运用冬虫夏草无性型深层发酵技术研究获得的发酵虫草菌丝产品，于上世纪80年代被批准作为中药材用于临床[1]。已往大量研究发现，发酵虫草菌粉具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、保护肝和肾等药理作用。为进一步研究发酵虫草菌粉发挥免疫调节作用的物质基础，从发酵虫草菌粉中水提获得多糖（CSMP60），并探究不同浓度CSMP60对脾细胞增殖、脾细胞分泌FINγ和巨噬细胞分泌TNFα的影响。
1材料与方法
11材料
111动物Balb/C小鼠（雌性，6～8周龄）：军事医学科学院实验动物中心，合格证号为军科院SCXK（军）2012001。饲养条件：温度22～26 ℃，湿度40%～60%，标准饲料喂养，自由饮水。
112药物发酵虫草菌粉，产地：江西国药，国药准字Z10890021。
发酵虫草菌粉多糖的制备：称取发酵虫草菌粉1 kg，向其中加入15 L去离子水，60 ℃条件下水浴浸提4 h，期间不时搅拌，然后用2层纱布滤过，滤过后的残渣在同样条件下进行第2次提取。合并两次提取的滤液，滤液在3 000 r/min、10 min条件下离心，离心后上清液于50～55 ℃减压浓缩获得水提浓缩液（浓缩约为1 L）。緩缓加入浓缩液3倍体积的95%乙醇，边加边搅拌，室温下静置醇沉72 h。混合体系在3 000 r/min、10 min条件下离心，分离沉淀部分，向沉淀部分中加入去离子水搅拌溶解，离心（3 000 r/min、10 min），再将沉淀同样操作3次。合并离心后的上清液，装入透析袋，用自来水透析72 h（一边透析一边摇晃），去除小分子杂质。将袋内透析液离心，上清液减压浓缩后，进行冷冻干燥，得到发酵虫草菌粉多糖（CSMP60）[25]。1 kg发酵虫草菌粉经水提醇沉、复溶、透析、浓缩、冷冻干燥得6653 g黄色粉末，得率为665%。
113试剂与仪器乙醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。刀豆球蛋白（Concanavalin A，ConA）和脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）：美国Sigma公司。RPMI 1640培养基：美国Hyclone公司。MTT：Amresco公司。DMEM培养液：Gibco公司。胎牛血清（FBS）：浙江天杭生物科技有限公司。胰蛋白酶：Amresco公司。十二烷基硫酸钠（SDS）：Amresco公司。其余试剂：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。红细胞裂解液（TrisNH4Cl缓冲液）：017 mol/L Tris与016 mol/L NH4Cl按1∶9混合，调pH为72，经022 μm滤膜滤过除菌，4 ℃存放。ELISA试剂盒：购自欣博盛生物科技有限公司。DLI15型台式封闭电炉：天津市泰斯特仪器有限公司。旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。分析天平：Ohaus公司。LGJ25 C冷冻干燥机：北京四环冻干机厂。DZF6020真空干燥箱：上海一恒科技有限公司。YTCJ2ND超净工作台：北京亚泰公司。DHP9161型电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司。流式细胞仪：FACS caliber，美国BD公司。MCO15AC型CO2细胞培养箱：日本三洋。CKX41型生物显微镜：日本OLYMPUS公司。YX280D型高压蒸汽消毒器：江苏江阴滨江医疗设备有限公司。96孔ELISA板：美国Costar公司。CF16RXⅡ型冷冻离心机：日本HITACHI公司。Varioskau Flash version 243酶标仪和F101620型洗板机：美国Thermo Scientific公司。
12方法
121分组与模型制备
1211分组分正常组、对照组（ConA组或LPS组）、给药组（低剂量组、中剂量组、高剂量组）。
1212小鼠原代脾细胞悬液的制备放血处死Bald/C小鼠，在超净台无菌条件下将取出的脾脏放在置于盛有10 mL RPMI 1640培养基的灭菌玻璃培养皿中的100目尼龙网筛上，然后用消毒的玻璃注射器针芯研磨脾脏，使其细胞滤过网筛，制成脾细胞悬液。以1 000 r/min离心脾细胞悬液10 min，弃上清，加入2 mL TrisNH4Cl缓冲液作用3～5 min，再加3 mL培养基同上离心洗涤2次，再次重悬细胞，用含20%FBS的RPMI 1640培养基调整细胞密度为5×109/L。
1213小鼠腹腔巨噬细胞悬液的制备处死小鼠，在超净台无菌条件下腹腔注射含5%FBS的RPMI 1640培养液，然后抽取腹腔溶液，离心10 min（600×g），弃上清，加入红细胞溶胀液后，用细胞培养液洗涤3次。用含10%FBS的RPMI 1640培养液重悬细胞，调整细胞密度为25×108/L。
122给药方法
将CSMP60溶解于细胞培养液中，配制成各种所需浓度的药物溶液添加于孔板中。
123检测指标与方法
1231MTT法测定CSMP60对小鼠原代脾细胞增殖的影响将上述调整细胞密度后的脾细胞悬液加入无菌96孔细胞培养板中，100 μL/孔。正常对照孔只加等体积的RPMI 1640培养液，其余各孔再分别加入100 μL不同浓度CSMP60（终浓度分别为10、50和250 mg/L）、ConA（终浓度2 mg/L）、LPS（终浓度15 mg/L）。每组设3复孔。将培养板置于5% CO2培养箱37 ℃孵育48 h。取出培养板，无菌条件下每孔取出100 μL上清弃去，加入5 g/L的MTT溶液20 μL，将培养板置于5% CO2培养箱37 ℃孵育4 h。取出培养板，在每孔中加DMSO 150 μL，用酶标仪检测570 nm吸光度（A570），计算细胞增殖百分率[68]。
1232MTT法测定CSMP60协同丝裂原对小鼠原代脾淋巴细胞增殖的影响将上述调整细胞密度后的脾细胞悬液加入无菌96孔细胞培养板中。设正常对照、ConA（终浓度2 mg/L）或LPS（终浓度15 mg/L）对照。正常对照孔只加RPMI 1640培养液，丝裂原对照孔加入ConA（终浓度2 mg/L）或LPS（终浓度15 mg/L）。其余各孔加入CSMP60（终浓度分别为10、50和250 mg/L），同时加入ConA（终浓度2 mg/L）或LPS（终浓度15 mg/L）。每组设3复孔。将培养板置于5% CO2培养箱37 ℃孵育48 h。取出培养板，无菌条件下每孔取出100 μL上清弃去，加入5 g/L的MTT溶液20 μL，将培养板置于5%CO2培养箱37 ℃孵育4 h。取出培养板，在每孔中加DMSO 150 μL，用酶标仪检测570 nm吸光度（A570），计算细胞增殖百分率。
1233测定CSMP60对小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNFα的影响将上述调整细胞密度后的巨噬细胞悬液加入24孔培养板，05 mL/孔，置于5% CO2培养箱37 ℃孵育2 h。吸去上清，用09% NaCl去除未贴附的细胞，然后每孔分别加入1 mL细胞培养液、LPS（终浓度15 mg/L）及CSMP60（终浓度分别为10、50和250 mg/L）。每组设3复孔，然后置于5% CO2培养箱37 ℃孵育48 h。离心，收集培养液上清，采用ELISA试剂盒测定细胞上清液中的TNFα含量[9]。
1234測定CSMP60对小鼠脾淋巴细胞分泌IFNγ的影响将上述调整细胞密度后的脾细胞悬液加入24孔细胞培养板中，每孔各加入05 mL。再加入05 mL CSMP60溶液，终浓度分别为10、50、250 mg/L。另设ConA（2 mg/L）和正常对照。每组设3复孔。然后将培养板置于5% CO2培养箱37 ℃孵育72 h，取出细胞培养液，离心10 min （600×g），收集上清液，按照ELISA试剂盒说明书测定脾细胞培养上清IFNγ含量[10]。按照ELISA试剂盒说明书测定脾细胞培养上清IFNγ含量[10]。
13统计学方法采用SPSS 130统计软件对数据进行分析，实验结果数据用均数±标准差（±s）表示，进行oneway ANOVA方差分析。以P<005为差异有统计学意义。
2结果
21CSMP60对小鼠原代脾细胞增殖的影响结果表明，在无丝裂原刺激的情况下，CSMF60能促进小鼠原代脾细胞的增殖，且呈现量效关系。中剂量CSMF60能协同LPS促进小鼠原代脾淋巴细胞增殖（P<005），CSMF60对ConA促进小鼠原代脾淋巴细胞增殖有协同作用的趋势。
3讨论
CSMP60是发酵虫草菌粉经水提而得的多糖，虽多糖已被公认是一类具有免疫活性的物质，但不同来源多糖的免疫活性往往不尽相同。目前对CSMP60如何发挥免疫调节作用，具体涉及到哪些效应细胞及细胞因子等问题还不是十分清楚，需要相应的实验研究作出回答。
脾脏含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，实验结果表明，CSMP60能促进脾细胞增殖，而在协同丝裂原促进脾淋巴细胞增殖方面却未见到CSMP60有明显的作用，这提示，巨噬细胞可能是CSMP60直接作用的主要免疫效应细胞。
CSMP60能促进巨噬细胞分泌TNFα，但对脾淋巴细胞分泌IFNγ的影响仅呈现出促进的趋势。TNFα主要是由活化单核巨噬细胞产生的细胞因子，是参与非特异性和特异性免疫的重要递质，它不仅能增强T、B淋巴细胞、单核巨噬细胞的活性，而且还具有抗肿瘤、抗病毒、调节机体代谢等多种生物学作用[11]。
综上所述，CSMP60是发酵虫草菌粉产生免疫活性的效应物质之一，可能主要通过非特异性免疫途径发挥作用，而通过TNFα这一“桥梁”，CSMP60对特异性免疫或许也有作用。对CSMP60免疫活性的进一步了解以及相关机制的探讨，还需进行深入的研究。
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（2018-03-31收稿责任编辑：王明）