【摘要】 目的：通過研究微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）、程序性死亡配体1（programmed death ligand 1，PD-L1）及白介素6（interleukin 6，IL-6）在人结直肠腺癌组织中的表达，探讨三者之间的相关性，分析其与结直肠腺癌临床病理学参数间的关系。方法：用免疫组化法对312例结直肠腺癌组织及30例癌旁组织中错配修复基因（Mismatch repair genes，MMRs）、PD-L1及IL-6的表达进行检测，分析MSI、PD-L1、IL-6三者之间的相关性及各指标与结直肠腺癌临床病理学参数间关系。结果：结直肠腺癌组织中，MSI表达率为16.3%，微卫星稳定（Microsatellite stability，MSS）表达率为83.7%。PD-L1及IL-6在结直肠腺癌组织中的阳性表达率与癌旁组织相比均明显上调（P<0.01）。结直肠腺癌组织中，MSI与PD-L1蛋白表达呈正相关（P<0.01），MSI与IL-6蛋白、PD-L1与IL-6蛋白表达均呈负相关（P<0.01）。MSI表达与患者低龄（≤60岁）、升结肠、低分化、无淋巴结转移相关，而PD-L1、IL-6表达仅与肿瘤分化程度相关。结论：结直肠腺癌组织中PD-L1和IL-6的表达均明显上调，均与结直肠腺癌的分化程度相关，可能作为结直肠腺癌恶性程度的评价指标及临床治疗的靶点；PD-L1表达增高与MSI状态及IL-6表达下调相关，通过检测MSI及IL-6表达情况，可能预测抗PD-L1免疫治疗的有效率，通过抑制肿瘤中IL-6的表达可能提高抗PD-L1治疗的有效率；MSI更多表达于低年龄、升结肠、分化差及无淋巴结转移患者，有利于免疫治疗的初步分流。
【关键词】 结直肠癌； PD-L1； IL-6； MSI
Expression and Significance of MSI，PD-L1 and IL-6 in Colorectal Adenocarcinoma/WANG Chao，ZHENG Huixia.//Medical Innovation of China，2018，15（26）：036-040
【Abstract】 Objective：To study the expression of microsatellite instability（MSI），programmed death ligand 1（PD-L1）and interleukin 6（IL-6） in human colorectal adenocarcinoma，to explore the correlation between them and the clinicopathological parameters of colorectal adenocarcinoma.Method：The expression of mismatch repair genes（MMRs），PD-L1 and IL-6 in 312 colorectal adenocarcinoma tissues and 30 adjacent tissues were detected by immunohistochemistry.Correlations of MSI，PD-L1 and IL-6，as well as the relationship between each index and clinicopathological parameters of colorectal adenocarcinoma was analyzed.Result：In colorectal adenocarcinoma，the MSI expression rate was 16.3%，and the microsatellite stability（MSS） expression rate was 83.7%.The positive rates of PD-L1 and IL-6 in colorectal adenocarcinoma were significantly higher than those in adjacent tissues（P<0.01）.In colorectal adenocarcinoma，MSI was positively correlated with PD-L1 protein expression（P<0.01）.MSI was negatively correlated with IL-6 protein expression， so was PD-L1 and IL-6 protein expression（P<0.01）.MSI expression was associated with younger age（≤60 years old），ascending colon，poorly differentiated，and no lymph node metastasis.The expression of PD-L1 and IL-6 was only related to the degree of tumor differentiation.Conclusion：The expression of PD-L1 and IL-6 in colorectal adenocarcinoma is significantly up-regulated，which is related to the differentiation of colorectal adenocarcinoma，and might be used as an index to evaluate the malignant degree of colorectal adenocarcinoma and as a target for clinical treatment.The increased expression of PD-L1 is associated with the down-regulation of MSI and IL-6 expression.By detecting the expression of MSI and IL-6，we could predict the effective rate of anti-PD-L1 immunotherapy，and increase the effective rate of anti-PD-L1 therapy by inhibiting the expression of IL-6 in tumor.The expression of MSI in patients with low age，ascending colon，poor differentiation and no lymph node metastasis is beneficial to the preliminary shunt of immunotherapy.
【Key words】 Colorectal cancer； PD-L1； IL-6； MSI
First-author’s address：Basic Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.26.009
结直肠癌在我国具有较高的发病率及死亡率[1]，许多患者发现时已失去手术机会，免疫治疗与化疗和放疗相比不良反应较轻[2]。微卫星又称简单重复序列，当错配修复基因（Mismatch repair genes，MMRs）缺失时，则会导致微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）。程序性细胞死亡受体1（PD-1）与其配体PD-L1结合引起免疫逃逸[3]，通过阻断PD-1/PD-L1可用于治疗肿瘤，研究表明MSI型结直肠癌对抗PD-L1免疫治疗反应良好[4-5]，但反应率非常低。IL-6是一种多效细胞因子，在MSI阳性肿瘤中低表达[6]，研究发现阻断IL-6可能提高抗PD-L1治疗的有效率。本文拟通过免疫组化法检测结直肠腺癌中MMRs、PD-L1及IL-6的表达，探讨结直肠腺癌中MSI、PD-L1及IL-6之间的相关性及各指标与结直肠腺癌临床病理学参数的关系，以期为结直肠癌抗PD-L1免疫治疗寻找一种新思路。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集山西医科大学第一临床医学院病理科2013年1月-2017年8月经外科手术切除的结直肠腺癌石蜡标本312例，30例癌旁组织作为对照。所有病例均为首发肿瘤，均有完整的临床、病理资料，HE染色切片均经高年资病理医师镜下明确诊断，术前未行放化疗等辅助治疗，癌旁组织距癌灶边缘10 cm以上（镜下未见癌细胞）。312例患者中，男174例，女138例；年龄37～86岁，平均（65.32±8.68）岁，>60岁213例，≤60岁99例；发生部位：降结肠、直肠123例，升结肠189例；分化程度（WHO大肠腺癌组织学分级）：高、中、低分化者分别为54、173、85例；淋巴结转移情况：有淋巴结转移者142例，无淋巴结转移者170例；临床病理分期（AJCC TNM分期标准）：T1期+T2期171例，T3期+T4期141例。
1.2 方法
1.2.1 试剂 抗MLH1单克隆抗体、抗MSH2单克隆抗体、抗MSH6单克隆抗体、抗PMS2单克隆抗体、抗PD-L1单克隆抗体、抗IL-6单克隆抗体、免疫组化试剂盒和DAB试剂（中杉金桥试剂公司）。
1.2.2 实验方法 按免疫组化试剂盒说明书进行。标本常规10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片脱蜡水化，3%H2O2清除内源性过氧化物酶活性，高压热修复，分别滴加鼠抗人MLH1单抗、兔抗人MSH2单抗、鼠抗人MSH6单抗、兔抗人PMS2单抗、鼠抗人PD-L1单抗、鼠抗人IL-6单抗，4 ℃过夜，复温后滴加二抗，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，镜检。PBS代替一抗作空白对照。
1.2.3 结果判定 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均表达于胞核，癌旁正常组织为内对照，癌组织中有一个细胞明显着色即判为亚型阳性，至少一个亚型表达缺失判为MSI表达阳性，各亚型均表达判为MSS表达阳性。PD-L1表达于胞膜/胞质，以50%着色判为表达阳性；IL-6表达于胞膜/胞质，采用半定量积分判定：在40倍镜下观察着色强度：细胞未着色（0分）、淡黄色（1分）、棕黄色（2分）、棕褐色（3分）；在400倍镜下判定阳性细胞百分比率：随机观察10个视野，阳性细胞百分比率为视野下阳性细胞数占所有瘤细胞的比值，取平均值，比值<5%（0分）、比值5%～25%（1分）、比值26%～50%（2分）、比值51%～75%（3分）、比值>75%（4分）[7]。将着色强度与阳性细胞百分率的得分相乘，得积为染色指数（SI）。SI>4为阳性表达，≤4为阴性表达。判定过程由2名经验丰富的病理医生负责。
1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0进行统计分析，计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验和Fisher确切概率法进行分析，两两指标表达相关性用Spearman相关检验，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MMRs、PD-L1及IL-6在结直肠腺癌及癌旁组织中的表达 结直肠腺癌组织中MSI表达率为16.3%（51/312），MSS表达率为83.7%（261/312），癌旁组织中MSI表达率为0，MSS表达率为100%（30/30）。PD-L1及IL-6在结直肠腺癌组织中的阳性表达率分别为19.9%（62/312）、79.5%（248/312），PD-L1及IL-6在癌旁组织中的阳性表达率分别为3.3%（1/30）、23.3%（7/30），比较差异均有统计学意义（字2=14.19、69.81，P<0.01）。MSI型结直肠癌患者中，PD-L1、IL-6的阳性表达率分别为90.2%（46/51）、2.0%（1/51）；MSS型結直肠癌患者中，PD-L1、IL-6的阳性表达率分别为1.9%（5/261）、94.6%（247/261）。见图1～3。
2.2 MSI、MSS、PD-L1及IL-6表达的相关性 312例结直肠腺癌组织中，MSI阳性表达51例，PD-L1阳性表达62例，MSI与PD-L1共同阳性例数为46例，共同阴性例数为245例，Spearman相关性分析显示MSI与PD-L1蛋白表达呈正相关（r=0.78，P<0.01），见表1。IL-6阳性表达248例，MSI与IL-6共同阳性例数为1例，共同阴性例数为14例，Spearman相关性分析显示MSI与IL-6蛋白表达呈负相关（r=-0.85，P<0.01），见表2。PD-L1与IL-6共同阳性例数为2例，共同阴性例数为4例，Spearman相关性分析显示PD-L1与IL-6蛋白表达呈负相关关系（r=-0.93，P<0.01），见表3。
2.3 MSI、PD-L1与IL-6与结直肠腺癌临床病理学参数之间的关系 （1）MSI在>60岁年龄组中的阳性表达率显著低于≤60岁年龄组（字2=9.21，P=0.004）；MSI在升結肠的阳性表达率显著高于降结肠、直肠（字2=9.08，P=0.004）；MSI在低分化组中阳性表达率明显高于高、中分化组（字2=47.87，P<0.01）；MSI在有淋巴结转移组中的阳性表达率显著低于无淋巴结转移组（字2=7.45，P=0.007）。MSI在结直肠腺癌中的表达与患者性别、肿瘤浸润程度差异无统计学意义（P>0.05）。（2）PD-L1在低分化组中的阳性表达率明显高于高、中分化组，差异有统计学意义（字2=71.92，P<0.01）。PD-L1在结直肠腺癌中的表达与患者年龄、性别、发生部位、淋巴结转移与否、肿瘤浸润程度均无关（P>0.05）。（3）IL-6在低分化组中的阳性表达率低于高、中分化组，差异有统计学意义（字2=179.21，P<0.01）。IL-6在结直肠腺癌中的表达与患者年龄、性别、发生部位、淋巴结浸润与否、肿瘤浸润程度均无关（P>0.05）。见表4。
3 讨论
近几年，结直肠癌发病率递增，预后较差[8]，传统的手术、放化疗等治疗具有其局限性，免疫治疗近年来备受推崇[9]。正常机体可将生长中的肿瘤进行免疫系统清除，但肿瘤可发生免疫逃逸。PD-L1和PD-1近年来作为癌症治疗的潜在目标受到密切的关注[10]，越来越多研究发现MSI型结直肠癌对抗PD-L1剂派姆单抗治疗有效[11]。然而结直肠癌对PD-1或PD-L1阻断的反应率非常低[12]，且部分PD-L1阳性肿瘤患者对PD-L1/PD-1阻断无效[13]。有研究发现IL-6水平可能影响结直肠癌对PD-L1治疗的反应[14]。本研究通过免疫组化法检测结直肠腺癌组织及癌旁组织中MMRs、PD-L1及IL-6的表达，分析了PD-L1、IL-6、MSI三者之间的相关性及其与结直肠腺癌临床病理学参数间关系，以期为结直肠癌的抗免疫治疗水平的提高寻求一种较新思路或治疗策略。
本研究发现，与癌旁组织相比，结直肠腺癌组织中PD-L1、IL-6表达均明显升高，与文献[15]报道一致，提示PD-L1、IL-6的高表达可能与结直肠腺癌的发生发展有关。MSI状态下PD-L1表达增高且IL-6表达下降，提示三者之间可能存在某种关联，进一步探索三者之间的相关性可能为提高临床免疫治疗找到一种新路径。于是进一步分析了MSI、PD-L1及IL-6三者之间的相关性，发现结直肠腺癌组织中，MSI与PD-L1蛋白表达呈正相关，MSI、PD-L1均与IL-6蛋白表达呈负相关。这提示三者之间关系密切，PD-L1表达上调与MSI状态及IL-6的表达下调相关，通过检测MSI及IL-6状态可能更有利于筛选出适于抗PD-L1免疫治疗患者，同时也能解释临床上出现的部分PD-L1阳性患者对PD-L1抗体耐药的情况，这种情况下可能患者肿瘤细胞IL-6表达上调，影响PD-L1抗体效果。同时，通过抑制肿瘤患者IL-6的表达有可能提高PD-L1抗体治疗的敏感性及有效率，将三者结合对于结直肠腺癌免疫治疗可能有较好的应用前景。在此基础上进一步分析了MSI、PD-L1及IL-6与患者结直肠腺癌临床病理学参数的相关性，发现MSI表达与患者低龄（≤60岁）、升结肠、低分化、无淋巴结转移相关，与患者性别及肿瘤浸润程度无关。PD-L1、IL-6表达仅与肿瘤分化程度相关，两者的表达均与患者年龄、性别、发生部位、淋巴结转移与否、肿瘤浸润程度无关。以上结果提示MSI有特定的某些临床特征，有利于免疫治疗的初步分流及肿瘤恶性程度的评估；另外PD-L1及IL-6在肿瘤中的表达上调可能参与了结直肠腺癌的发生发展，两者与肿瘤分化程度相关，在一定程度上提示了肿瘤的恶性程度，可能作为结直肠腺癌的有效预后标记物及临床治疗的靶点。
综上所述，MSI及PD-L1、IL-6的表达上调均可能参与了结直肠癌的发生发展，三者之间具有一定联系，目前此项研究尚少，需要更多研究数据及功能学的验证。将三者结合研究用于临床可能有利于提高结直肠癌的免疫治疗有效率，改善目前免疫治疗受益人群低的情况。本研究为探索结直肠癌的免疫治疗提供了一种新的可能，IL-6也有望作为一个新的靶点，用于结直肠腺癌的临床治疗。
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（收稿日期：2018-04-03） （本文編辑：张爽）