[摘要] 目的 考察雪蛤颗粒的安全性。 方法 以SD大鼠和昆明种小鼠为受试动物，对雪蛤颗粒进行了急性毒性试验、遗传毒性试验（Ames试验、骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验）、大鼠30 d喂养试验的研究。 结果 SD大鼠急性毒性试验经口最大耐受量（MTD）大于15 g/kg，判断雪蛤颗粒属无毒类；Ames试验、骨髓细胞微核试验、小鼠精子畸形试验3项遗传毒性试验结果均为阴性；大鼠30 d喂养试验：最高剂量为人体推荐摄入量的100倍，未引起大鼠整体健康状况、生理生化功能和器官组织形态学等各项重要指标的异常变化。 结论 雪蛤颗粒无明显毒副作用，为其安全性评价提供了一定的依据。
[关键词] 雪蛤；安全性；SD大鼠；小鼠
[中图分类号] R994.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）03（a）-0032-04
Study on the safety and toxicity of Hashima Granules
PENG Xiaohui1 YU Xianghong1 LE Zhiyong2▲
1.Health Product Development， Kangmei（Beijing） Pharmaceutical Research Institute Company Limited， Beijing 102600， China； 2.Kangmei Pharmaceutical Company Limited， Guangdong Province， Guangzhou 515300， China
[Abstract] Objective To study the safety and toxicity of the Hashima Granules. Methods SD rat and Kunming mice were as test subjects， Acute oral toxicity test， genetic toxicity test （including Ames test， bone marrow micronucleus test and mouse sperm abnormality test）， 30 days feeding study in rats of Hashima Granules were carried on. Results MTD of acute oral toxicity test on SD rats was greater than 15 g/kg， and three genetic toxicity tests including Ames test， bone marrow micronucleus test， mice sperm abnormality test were all negative； 30 days rat feeding test showed that the highest dose was 100 times of recommended human intake， which did not cause abnormal changes in the key indicators of the overall health status， physiological and biochemical function and morphology and other organs and tissues of rats. Conclusion No obvious toxic and side effects of the Hashima granules are provided for the safety evaluation of the Hashima Granules.
[Key words] Hashima Granules； Safety； SD rat； Mice
雪蛤又称林蛙油、哈蟆油，为蛙科动物中国林蛙（Rana temporaria chensinensis David）雌蛙的输卵管，经干燥后形成的脂肪状物质，其性甘、咸、平，归肺、肾经，具有补肾益精、养阴润肺的功效 。雪蛤是一种传统的名贵中药，富有滋补软黄金的美誉，在我国清代被列为皇宫供品。雪蛤主要成分是蛋白质，其次为糖类及脂肪，此外还含有人体所必需的多种微量元素[1-5]。现代研究表明，雪蛤具有增强免疫力、缓解体力疲劳、调节人体内分泌、调节血脂、抗氧化、延缓衰老等多种保健作用[6-10]。但目前国内外对其毒性研究还很少，为研究雪蛤颗粒的安全性，本试验考察了雪蛤颗粒的急性经口毒性试验、遗传毒性试验和大鼠30 d喂养试验，为该产品的开发利用提供试验依据[11]。
1 一般材料
1.1 试验样品
雪蛤颗粒，6 g/包，批号：20131101，由康美药业股份有限公司提供。
1.2 实验动物
SPF级昆明种（KM）小鼠，雌雄各半，3月龄，25～30 g；30 d喂养试验用SPF级SD大鼠，雌雄各半，21日龄，60～75 g，均来自四川省中医药科学研究院实验动物中心，动物合格证号：SCXK（川）2014-0009。急性毒性试验用SPF级SD大鼠，雌雄各半，3月龄，体重为180～220 g，由四川省人民医院实验动物研究所养殖研究室提供。 动物经适应性喂养后进行试验，饲养于屏障级动物房[许可证号：四川省实验动物管理委员会SYXK（川）2013-011]。饲料由成都达硕生物科技有限公司提供，饮水为纯净水，整个实验期间动物自由饮水和摄食，动物房温度维持在20～26℃，相对湿度40%～70%。
2 方法与结果
2.1 方法
2.1.1 急性毒性试验（MTD法）
SD大鼠20只，雌雄各半。设一个15 g/kg剂量组。准确称取雪蛤颗粒90 g，加蒸馏水至240 mL混匀，按2 mL/100 g于动物空腹状态下分2次经口灌胃，间隔4 h，灌胃后观察两周内动物死亡数及一般健康状况，根据最大耐受量判断雪蛤颗粒的急性毒性[12]。
2.1.2 遗传毒性试验
2.1.2.1 Ames试验 采用符合要求的TA-97、TA-98、TA-100、TA-102菌株，进行加与不加大鼠肝S9的标准平皿掺入法试验（S9mix用量为0.5 mL/皿）。雪蛤颗粒设5个剂量：8、40、200、1000、5000 μg/皿[准确称取雪蛤颗粒0.5 g于玻璃瓶中，加蒸馏水至10 mL，充分混匀后即为最高工作浓度50 mg/mL，其余浓度用蒸馏水1/5往下稀释获得，配制的最高工作浓度液100 μL加入平皿即为最高终浓度5000 μg/皿，其余浓度加样量均为100 μL。所有配制好的雪蛤颗粒溶液采用8磅（1磅=7142 Pa）15 min高压方式进行灭菌]，同时设立自发对照组、溶剂对照组（灭菌蒸馏水100 μL/皿）和阳性对照组。不加S9试验的阳性对照组为0.2 μg/皿的TA97、TA98，1.5 μg/皿的叠氮化钠（TA100），0.5 μg/皿的丝裂霉素C（TA102）；加S9试验的阳性对照组为0.2 μg/皿的TA97、TA98、TA100和50 μg/皿的TA102。每个试验剂量设3个平行皿，进行一次重复试验[13-15]。
2.1.2.2 骨髓细胞微核试验 KM小鼠（SPF级），随机分为5组，雌雄各半，10只/组。设雪蛤颗粒（低2.5 g/kg、中5.0 g/kg、高10.0 g/kg）3个试验组，另设阴性对照组（蒸馏水）、阳性对照组（环磷酰胺40 mg/kg）。动物分别于第0小时和第24小时按2 mL/100 g经口灌胃，末次染毒后6 h处死，按规定制片。每只动物计数1000个嗜多染红细胞（PCE），观察含有微核的嗜多染红细胞数，微核率以含微核的嗜多染红细胞千分率表示；每只动物计数200个嗜多染红细胞中PCE和成熟红细胞（NCE）所占数目，计算PCE/NCE比值[16]。
2.1.2.3 小鼠精子畸形试验 KM雄性小鼠，随机分为5组，每组5只。分别为阴性对照组（蒸馏水）、阳性对照组（环磷酰胺40 mg/kg）和高10.0 g/kg、中5.0 g/kg、低2.5 g/kg 3个剂量组。按2 mL/100 g经口灌胃小鼠，连续5 d。在首次灌胃后第35天处死动物，摘取双侧附睾，按要求制片，每只动物观察1000个完整精子，记录各类畸形精子数[17]。
2.1.3 30 d喂养试验
断乳SD大鼠按体重随机分为4组，每组20只，雌雄各半。设对照组（基础饲料）和3、7、10 g/kg 3个雪蛤颗粒剂量组，分别相当于人体推荐量的30、70、100倍。各剂量组饲料中雪蛤颗粒含量分别为30、70、100 g/kg（饲料），加工成颗粒饲料喂养动物，由于中、高剂量组雪蛤颗粒含量掺入饲料的量超过5%，故通过调整各组干酪素添加量使各组蛋白质含量基本一致（每千克饲料中，低剂量组添加干酪素1.69 g，中剂量组添加干酪素4.22 g，高剂量组添加干酪素5.63 g）。动物自由摄食30 d。一周称一次体重、两次食物摄入量，计算摄食量，连续饲养30 d后处死动物，进行血清生化学、血液学、脏器系数测定及组织病理学检查[18-21]，分别按周摄食量及周增重计算食物利用率=周食用量/周体重增长质量×100%。
2.2 统计学方法
采用PEM3.1《中国医学百科全书·医学统计学》统计软件包（第三版）对数据进行统计分析，各实验组和对照组均数比较使用方差分析，若方差不齐采用秩和检验，精子畸形率的比较采用秩和检验，微核率的比较使用泊松分布法。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2.3 试验结果
2.3.1 急性毒性试验
雪蛤颗粒15 g/kg剂量经口染毒两周内未见动物死亡，亦无明显中毒症状或不良反应。即雪蛤颗粒对雌、雄SD大鼠的急性经口MTD大于15 g/kg，按《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）判属无毒类。见表1。
2.3.2 遗传毒性试验
2.3.2.1 Ames试验 无论加与不加S9，自发对照组每皿平均回变菌落数都属正常值范围内，阳性对照组诱发的每皿平均回变菌落数均达到自发对照组2倍以上，呈明显阳性反应。溶剂对照组和雪蛤颗粒各剂量组的平均回变菌落数均未超过自发对照组的1倍，呈阴性反应，说明雪蛤颗粒无诱导试验菌株回复突变的作用。见表2。
2.3.2.2 小鼠骨髓细胞微核试验 与阴性对照组比较，雪蛤颗粒各剂量组PCE/NCE比值比较差异无统计学意义（P > 0.05），表示雪蛤颗粒对小鼠骨髓细胞增殖无不良影响。泊松分布法结果显示，阳性对照组雌、雄动物的微核率均显著高于阴性对照组（P < 0.05），雪蛤颗粒各剂量组的微核率与阴性对照组比较差异均无统计学意义（P > 0.05），表示雪蛤颗粒在小鼠骨髓细胞微核试验中为阴性结果。见表3。
2.3.2.3小鼠精子畸形试验 秩和检验结果显示，阳性对照组的精子畸形率显著高于阴性对照组（P < 0.05），雪蛤颗粒各剂量组的精子畸形率与阴性对照组比较差异均无统计学意义（P > 0.05），提示在小鼠精子畸形试验中雪蛤颗粒为阴性结果。见表4。
2.3.3 大鼠30 d喂养试验
对照组和3个剂量组动物在30 d喂养期间，摄食、饮水、大小便均正常，生长发育情况良好，未观察到明显行为改变和中毒表现。
2.3.3.1 对体重和食物利用率的影响 雪蛤颗粒各剂量组的动物增重、摄食量、食物利用率基本正常。
2.3.3.2 对脏器系数的影响 雪蛤颗粒各剂量组的重要脏器重量和脏器系数（脏器湿重/空腹体重×100）基本正常。
2.3.3.3 末期血液学检验结果 试验末期的常规血液学指标（红细胞、血红蛋白、白细胞及分类）测定结果。雪蛤颗粒各剂量组雌、雄鼠的测定指标与对照组比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表5。
2.3.3.4 末期生化指标检验结果 低剂量组雄鼠的BUN和GLU显著低于对照组（P < 0.05），中剂量组雌鼠的TP显著低于对照组（P < 0.05），单变化在本实验室历史对照范围之内，并无生物学意义。与阴性对照组比较，雪蛤颗粒其他各剂量组雌、雄鼠的肾功、肝功、血糖和血脂等生化指标差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表6。
2.3.3.5 组织学检查结果 试验结束后对试验动物进行了检查，未发现明显病变，所以仅选高剂量组和对照组动物的肝、肾、脾脏、空肠、睾丸和卵巢行组织学检查。结果高剂量组各种病变例数与对照组比较差异无统计学意义，显示少数动物所出现的病变与雪蛤颗粒无关，应属动物的自发病变。综上所述，各剂量组动物脏器均未见由雪蛤颗粒引起的损害性改变。
3 讨论
雪蛤颗粒对大鼠的急性经口MTD大于15 g/kg，按《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）急性毒性分级标准，判为无毒类。3项遗传毒性试验（Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验）均为阴性结果。在大鼠30 d喂养试验中动物生长发育良好，各剂量组血液学指标、生化指标以及器官组织形态未见异常变化，差异无统计学意义（P > 0.05）。据此初步推算雪蛤颗粒的最大无作用剂量大于10 g/kg（相当于人体推荐量的100倍），在本实验范围内雪蛤颗粒无毒、无遗传毒性，作为保健食品是安全的，可进一步开发研究。
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（收稿日期：2015-11-15 本文编辑：赵鲁枫）