摘要目的：对桃仁和苦杏仁进行分子鉴定研究，建立基于ITS序列位点特异性的PCR鉴定方法。方法：收集桃仁、苦杏仁样品，提取基因组总DNA，用ITS通用引物进行测序，通过BioEdit软件进行序列比对，根据特异位点设计鉴别引物进行特异性PCR反应，并对PCR反应条件进行了优化。结果：基于ITS序列设计的特异性鉴别引物G47可以用于桃仁和苦杏仁的鉴别研究，在位点特异性PCR反应条件考察中，25 μL反应体系DNA模板用量适宜范围为005～1 ng，退火温度在59 ℃时特异性最佳，实验建立的方法对不同DNA聚合酶和PCR仪均具有普适性。结论：该研究设计的位点特异性引物在一定条件下的PCR反应中，桃仁能够扩增出333 bp清晰条带，而苦杏仁没有该条带，从而实现了桃仁与苦杏仁的快速、准确鉴别。
关键词桃仁；苦杏仁；ITS；位点特异性PCR；分子鉴定
Identification of Persicae Semen and Armeniacae Semen Amarum by PCR Amplification of Specific Alleles Based on ITS Sequences
Gao Linhui1，Yin Yan2，Li Jia1，Ma Yuemeng1，Li Wenbin1，Li Bowen1，Zhang Xia′nan1
（1 School of Traditional Chinese Medcine，Capital Medical University，Beijing 100069，China； 2 School of Pharmaceutical Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025，China）
AbstractTo identify Persicae semen amarum using DNA molecular identification，and establish classical PCR identification mesthod.The internal transcribed spacer （ITS） of nuclear ribosomal DNA of Persicae Semen and Armeniacae semen amarum were amplified and bidirectionally sequenced.ITS sequences were analysed by BioEdit.Specific identification primers were designed according to the ITS sequences of specific alleles，and PCR reaction system was optimized.Persicae Semen and Armeniacae Semen Amarum can be identificated by the specfic peimers G47 based on ITS sequences.In the condition′s concentration is between 0051 ng for a 25 μL PCR reaction，the best annealing temperature is 59 ℃.This method is well used for different DNA polymerases and different PCR instruments.The result showed that the 333 bp identification band can be amplified in Persicae semen，while it can not be amplified in Armeniacae semen amarum.It is confirmed that the PCR amplification system of specific alleles can be used to identify Persicae semen and Armeniacae semen amarum fastly and accurately.
Key WordsPersicae Semen； Armeniacae Semen Amarum； ITS； PCR amplification of specific alleles； Molecular identification
中圖分类号：R284；R917文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.09.050
桃仁为蔷薇科植物桃Prunus persica（L）Batsch或山桃Pdavidiana（Carr）Franch的干燥成熟种子，性平，味苦、甘，归心、肝、大肠经，具有活血祛瘀，润肠通便，止咳平喘之功效，用于经闭痛经，癥瘕痞块，肺痈肠痈，跌扑损伤，肠燥便秘，咳嗽气喘[1]。苦杏仁为蔷薇科同属植物山杏Parmeniaca Lvaransu Maxim、西伯利亚杏Psibirica L、东北杏Pmandshurica（Maxim）Koehne或杏Parmeniaca L的干燥成熟种子，性微温、味苦，归肺、大肠经，具有降气止咳平喘，润肠通便之功效，用于咳嗽气喘，胸满痰多，肠燥便秘[1]。桃仁与苦杏仁在外观上非常相似，经脱皮、炮制加工后更难区分，然而两者药理作用显著不同，桃仁属于活血化瘀药，杏仁属于止咳平喘药。且两者主要化学成分均为苦杏仁苷，应用传统鉴别方法容易出现误差。此外，苦杏仁中苦杏仁苷含量较高，该化合物被苦杏仁酶代谢分解后会产生有毒的氢氰酸，过量则会引起中毒，桃仁和苦杏仁的混用容易引起潜在的用药风险[2]。因此，建立一种快速、简易、准确鉴定桃仁和苦杏仁的分子鉴定体系，对于控制桃仁的药材质量以及用药安全都具有十分重要的意义。本实验基于ITS序列位点特异性PCR技术对桃仁和苦杏仁药材样品进行鉴别，设计特异性鉴别引物并对特异性PCR反应条件进行了摸索和优化，实验确定的鉴别方法稳定、快速，为桃仁和苦杏仁的准确鉴别提供依据。
1材料与方法
11样品
桃仁与苦杏仁样品来源有：购自河北安国中药材市场和安徽亳州药材市场的药材，由首都医科大学中医药学院李佳副教授鉴定（编号：1，2，10，11，12，19）；采集自山西、河北、北京的桃仁、山桃仁、苦杏仁样品由北京中医药大学刘春生教授鉴定（编号：8，9，18，24，25，26）；全国中药资源普查中心提供的桃仁與苦杏仁样品（编号：3，4，5，6，7，13，14，15，16，17，20，21，22，23），样品信息见表1。桃仁标准药材（山桃，121560201302，编号T）、苦杏仁标准药材（杏，121554201204，编号X）购于中国食品药品检定研究院。NCBI下载序列见表2。
12仪器
PCR仪（Applied Biosystems Veriti；Eppendorf AG 22331）；微量核酸定量仪（NanoDrop 2000C）；高级荧光化学发光系统（FUSIONSL）。
13试剂
植物基因组DNA提取试剂盒（离心柱型DP3052，TIANGEN）；2×EasyTaq PCR SuperMix（AS111，TRANS）；2×Taq PCR StarMix（A112，GenStar）；Ex Taq DNA聚合酶（RR53AM，TakaRa）；Phusion超保真PCR Master Mix（M0531，BioLab）；2K DNA Marker（E110，TransGen）。
14方法
141基因组DNA的提取、通用引物PCR扩增及测序
取样品约100 mg，经粉碎后，用植物基因组DNA提取试剂盒提取各药材总DNA，最后用50 μL无菌水洗脱。样品用通用引物ITS[3]（序列见表1）以高保真酶扩增样品DNA并进行双向测序。PCR扩增体系为Phusion超保真PCR Master Mix 125 μL，正反向引物各075 μL，DNA 2 μL，无菌水9 μL，总体系25 μL。PCR扩增程序见表3。PCR产物由北京睿博兴科生物技术有限公司测序部测序，各样品均采用正反双向测序，以保证结果的准确性。
142序列分析
将测序结果与网上桃仁与苦杏仁序列用CLUSTAL X软件进行序列比对，使用MEGA6用邻接（NJ）法构建系统聚类树，Bootstrap（1000次重复）检验各分支的支持率。
143特异性鉴别引物的设计
将所测得的序列与GenBank中的桃仁与苦杏仁ITS序列用BioEdit软件进行比对分析，找出具有稳定差异的特异性片段，筛选获得变异位点，通过该位点运用Premier Primer 50软件针对桃仁的特异性片段设计多对鉴别引物，并由睿博兴科生物技术有限公司合成。
144PCR引物特异性筛选
用所设计引物进行PCR反应，PCR所用25 μL反应体系为：2×EasyTaq PCR Super Mix 125 μL，正反向引物各05 μL，DNA稀释20倍后取1 μL，无菌水补齐。PCR产物采取琼脂糖凝胶电泳方法检测。以结果出现整齐、清晰条带为阳性，其余为阴性，由此判断引物特异性。
145特异性PCR反应条件优化
为获得最优的位点特异性PCR反应条件，对其反应条件进行优化，分别考察了DNA模板浓度（0005 ng/μL、001 ng/μL、002 ng/μL、005 ng/μL、01 ng/μL、02 ng/μL、025 ng/μL、05 ng/μL、1 ng/μL、2 ng/μL）、退火温度（55 ℃、57 ℃、59 ℃、61 ℃、63 ℃）、聚合酶种类（Ex Taq DNA聚合酶、2×Taq PCR StarMix、2×EasyTaq PCR SuperMix）、不同PCR仪（Applied Biosystems Veriti；Eppendorf AG 22331）对PCR反应的影响。反应体系为：DNA聚合酶125 μL，正反向引物各05 μL，DNA 1 μL，无菌水补足25 μL。
2结果与分析
21通用引物PCR扩增电泳结果
ITS通用引物扩增样品的成功率为100%，即全部具有明亮清晰条带。扩增结果如图1。
22基于ITS序列桃仁与苦杏仁样品的系统进化树构建
采用Mega 6分析软件进行桃仁与苦杏仁系统发育树的构建，采用邻接法（NJ）构建系统发育树。见图2，采用Kimura2parameter距离，系统树各分支的置信度用bootstrap method检验，共进行1 000次循环。由图2可知，桃仁样品与桃仁标准药材聚为一支，苦杏仁与苦杏仁标准药材聚为一支，表明ITS序列用于桃仁与苦杏仁的分子鉴定具有一定的理论依据。
23特异性引物PCR扩增
用筛选的特异PCR引物G47（序列见表3）对提取的桃仁和苦杏仁DNA模板进行扩增。如图3所示，桃仁标准药材与桃仁样品特异性扩增结果呈阳性，条带整齐、清晰明亮，大小333 bp，而苦杏仁标准药材与苦杏仁样品特异性扩增结果均呈阴性，证明该引物具有良好的特异性。
24PCR扩增反应条件优化
241DNA模板量的考查
对25 μL PCR反应体系中的模板DNA用量进行了考察，结果如图4，DNA模板浓度在2 ng/μL时苦杏仁出现假阳性条带，而在002 ng/μL时桃仁不能出现清晰、明亮条带，且其引物二聚体明显增多（见图4），因此确定本方法DNA模板浓度适宜范围应为005～1 ng/μL。实验采用005 ng/μL DNA模板浓度继续进行其他条件的考察。
242退火温度的考查
设置退火温度分别为55 ℃、57 ℃、59 ℃、61 ℃、63 ℃进行考察，结果见图5。从结果可见，桃仁均出现整齐、清晰条带，而苦杏仁均无条带，表明退火温度对其无明显影响，采用59 ℃作为此方法的退火温度。
243DNA聚合酶的考察
对Ex Taq DNA聚合酶，2×Taq PCR StarMix，2×EasyTaq PCR SuperMix 3种聚合酶进行考察。结果如图6。采用不同聚合酶的PCR反应，伪品均无条带，而正品均有333 bp特异性扩增条带，说明特异性引物可用多种酶进行实验，无单一局限性。
244PCR仪对实验结果重复性的影响
选用2种不同型号的PCR仪（Eppendorf AG 22331、Applied Biosystems Veriti）进行考察，结果桃仁均出现整齐、明亮清晰的条带，苦杏仁均无条带出现（图7），表明此方法稳定性好，重复性高，PCR仪对其结果无明显影响。
3讨论
由于桃仁品种繁杂，形态变异大，且与苦杏仁形态相似，尤其是山桃仁在形态上与杏仁更加难以区分，故传统鉴别在实际应用中很难将两者准确区别。位点特异性引物PCR具有操作简单、成本低、重复性好等优点，使用特异性引物可以极大降低PCR的假阳性率，保证鉴定结果的准确性[4]，特别是近年来快速PCR技术迅速发展，使得中药材分子鉴定在现场快速鉴定上的应用成为了可能[56]。如李振华等[7]通过位点特异PCR的方法证明了荒漠肉苁蓉能扩增出331 bp的条带，而混伪品不能，从而实现了荒漠肉苁蓉与其混伪品的快速、准确鉴别。陈康等[8]在位点特异性引物PCR方法的基础上改良实验条件，应用快速PCR方法通过显示荧光区分真伪蛇类药材，所建立的蛇类药材快速PCR真伪检测方法可在30～45 min完成。赵丹等[9]对太子参药材及其混伪品的rDNAITS片段进行比对分析，应用特异性引物PCR方法将太子参药材及其混伪品进行了很好的区分。
DNA条形码技术在物种鉴别分类上起到了越来越重要的作用[1012]。植物常用鉴别序列是ITS序列，包括ITSl、ITS2，分别位于18S～58S rDNA、58S～26S rDNA之间，长度分别为187～298 bp和187～252 bp，而18S、58S、26S rDNA的序列又非常保守，所以其通用引物可适用物种范围广泛[13]。Chen等[3]比较了药用植物中7个候选的DNA条形码（psbAtrnH、rbcL、matK、rpoC1，ycf5，ITS2以及ITS），并且测试了ITS2鉴别753个属4 800个物种的6600个样品的成功率，结果为其鉴别成功率在种水平上为927%，最终认为ITS2可做为更广泛的药用植物鉴别DNA条形码。林韵涵等对药材桃仁及其近缘种进行分子鉴定，结果表明ITS2序列作为DNA条形码可以有效地鉴定药材桃仁及其近缘种。因此本实验最初选用桃仁及苦杏仁药材ITS2序列进行测序，但由于其亲缘关系较近，序列相似度较高，且多处均为单个碱基的不同，因此难以设计鉴别度较好的特异引物。中国植物条形码工作组[14]对来自42目75科141属1 757个物种的6 286个种子类植物样本的rbcL，matK，psbAtrnH，ITS序列进行研究，结果表明ITS有最高的鉴别能力，建议ITS/ITS2应成为种子植物的核心条形码。因此本实验即对桃仁及苦杏仁药材ITS序列进行测序，2种药材ITS序列中Poly结构较多，突变缺失情况较严重，并不是所有药材均能测序成功，但根据所测序结果以及与网上序列进行比对分析，设计特异性鉴别引物，结果表明其引物特异性好，鉴别能力高，可作为桃仁及苦杏仁药材鉴别的特异引物。
本实验通过特异引物筛选和条件优化，最终确定25 μL PCR反应体系时，引物G47在DNA模板加样量005～1 ng范围内，退火温度55～63 ℃时可将桃仁与苦杏仁进行有效的鉴别。该方法灵敏度高，稳定性好，可用于桃仁与苦杏仁的分子鉴别以及桃仁药材分子鉴定的推广与应用，且为桃仁药材的快速鉴别提供了参考依据。
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（2016-11-30收稿责任编辑：杨觉雄）