[摘要] 目的 探討急性一氧化碳中毒（ACOP）对大鼠少突胶质细胞前体细胞（OPCs）迁移的影响。 方法 采用差速贴壁法体外纯化培养大鼠OPCs，免疫荧光法鉴定OPCs纯度和形态，将其分为两组，ACOP组：将细胞放在密闭容器内，根据体积比例注入1%一氧化碳，建立ACOP的OPCs细胞模型，处理6、24 h和48 h；对照组：不进行任何处理，在5%CO2、37℃条件下培养6、24 h和48 h。两组均在6、24 h和48 h利用Transwell方法观察OPCs迁移情况。 结果 免疫荧光显示纯化培养的OPCs 95%以上表达NG2和PDGF-α，不表达GFAP和C-D11b；对照组迁移到小室穿透膜上的OPCs细胞数量自6 h到48 h逐渐增多，而ACOP组迁移的OPCs细胞数量逐渐减少；与对照组比较，ACOP组迁移到小室穿透膜上的OPCs细胞数量在6 h开始下降，但差异无统计学意义（P > 0.05），在24 h及48 h时迁移到小室穿透膜上的OPCs细胞数量明显下降（P < 0.05）；其中，在ACOP后48 h迁移的OPCs细胞数量下降最显著（P < 0.01）。 结论 ACOP会抑制OPCs细胞迁移能力，且随着中毒时间的增加而加重，从而阻碍损伤CNS髓鞘的修复，进一步阐明该机制可能对认识一氧化碳中毒迟发性脑病及寻找更有效的治疗手段具有非常重要的意义。
[关键词] 一氧化碳中毒；少突胶质细胞前体细胞；迁移
[中图分类号] R595.105 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）12（c）-0049-04
[Abstract] Objective To explore the effect of acute carbon monoxide poisoning （ACOP） for the migration of oligodendrocyte precursors （OPCs） in rats. Methods The OPCs model of rats was purified cultured by differential attachment in vitro， the purity and morphology of OPCs was identified by immumofluorescence method， they were divided into two groups， ACOP group： the cells were placed in a sealed container， which was injected 1% carbon monoxide by the volume ratio to establish OPCs cell model of ACOP， for 6， 24 h and 48 h； control group： the cells were cultured without any treatment， they were cultured for 6， 24 h and 48 h under the conditions of 5%CO2， 37℃； the OPCs migration of the two groups was observed by Transwell method at 6， 24 h and 48 h. Results The results of immunofluorescence showed that， more than 95% percent of purified cultured OPCs expressed NG2 and PDGF-α and did not express GFAP and CD11b； the number of OPCs migrated to the transmemberane of transwell in the control group was gradually increased from 6 h to 48 h， while the number of OPCs in ACOP group was gradually decreased； compared with control group， the number of OPCs migrated to the transmemberane of transwell in ACOP group began to decrease at 6 h， while there was no statistically significant difference （P > 0.05）， the number of OPCs migrated to the transmemberane of transwell in ACOP group was decreased significantly at 24， 48 h （P < 0.05）； among which， the migrated number of OPCs was decreased most significantly after 48 h of ACOP （P < 0.01）. Conclusion ACOP can inhibit the migration of OPCs， which will be more serious with the extension of poisoning time， thus hindering the repair of damaged CNS myelin. To further clarify the mechanism has very important significance to understand delayed encephalopathy after carbon monoxide poisoning and look for more effective therapy.
[Key words] Carbon monoxide poisoning； Oligodendrocyte precursors； Migration
一氧化碳（carbon monoxide）是一种无色无味的窒息性气体，人体一旦吸入过量，就会造成急性一氧化碳中毒（acute carbon monoxide poisoning，ACOP），立即造成多系统损害，其中以中枢神经系统（central nervous system，CNS）损伤最为严重，极易发生一氧化碳中毒迟发性脑病（delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP）。脱髓鞘改变被认为是DEACMP最主要的病理改变之一，但目前机制尚不完全清楚。少突胶质细胞前体细胞（oligodendrocyte precursors，OPCs）是脑内广泛存在的一大类胶质细胞，最初主要从室管膜区产生并经过发育期的长距离迁移而到达大脑的各个区域。OPCs的迁移过程是神经元正常形成髓鞘的必要条件，还对大脑损伤后髓鞘的修复至关重要。本研究采用差速贴壁法体外纯化培养大鼠OPCs，建立ACOP的OPCs细胞模型，观察ACOP对OPCs的迁移情况影响，探讨ACOP后CNS损伤及DEACMP的发病机制。
1 材料与方法
1.1 动物与试剂
实验用SD大鼠孕鼠（E16-E18）购自军事医学科学院实验动物中心，动物合格证号：SGXK（京）20022003。胎牛血清、胰蛋白酶、B27、Eagle"s MEM购自美国GIBCO公司；PDL、DAPI试剂购自美国Sigma公司；Rat FGF、Human PDGF-AA购自Peorotech公司。鼠抗NG2、兔抗PDGF-α、鼠抗GFAP和鼠抗CD11b购于美国Abcam公司；cy-3、FITC标记羊抗小鼠IgG购于中杉金桥公司。
1.2 体外OPCs纯化培养
实验采用孕16 d的SD大鼠，乙醚麻醉解剖镜下取胎鼠皮层，机械分离吹打成细胞悬液并用20 μm直径的尼龙筛网过滤重悬，以3×107个/培养皿的密度种入PDL预先包被的100 mm无菌培养皿中，以含有10% FBS的Eagle"s MEM 培养液在37℃含5%CO2的培养箱中连续培养5 d。5 d后，将培养皿中的细胞用0.05%的胰蛋白酶消化并吹打成细胞悬液，1000 r/min离心5 min（离心半径为4 cm）后重悬并用20 μm直径的尼龙筛网过滤，以8×106个/培养皿的密度种入无PDL包被的60 mm无菌培养皿中，以含有10% FBS的Eagle"s MEM培养液在37℃培养箱中继续培养6 d。6 d后，将培养皿中的细胞再次用0.025%的胰蛋白酶消化，并将神经球周围生出的很多具有两极或多极突起的OPC细胞轻轻吹打成细胞悬液，1000 r/min离心5 min（离心半径为4 cm）后重悬并用20 μm直径的尼龙筛网过滤，以1×106个/mL的密度种入无PDL包被的玻片上，含10% FBS的MEM培养液培养1 d后以备实验。
1.3 ACOP的OPCs细胞模型
将体外培养的OPCs细胞分为对照组和ACOP组进行实验。ACOP组：将细胞放在密闭容器内，根据体积比例注入1%一氧化碳（用一氧化碳检测仪检测，容器内一氧化碳浓度为10 000 ppm），处理6、24 h和48 h后进行免疫荧光和迁移检测。对照组：不进行任何处理，在5%CO2、37℃条件下培养。
1.4 免疫荧光染色
在干预各时间点吸除细胞玻片上的原培养基，用0.1×PBS漂洗3次，用预冷的多聚甲醛（4%）固定10 min，0.1×PBS漂洗3次，用含0.2% triton-X100的PBS室温破膜10 min，PBS漂洗3次，0.1% BSA室温封闭1 h，加入一抗，4°C过夜，次日PBS清洗，加入对应二抗避光条件下室温孵育1 h，0.1×PBS漂洗3次，用50%甘油封片，荧光显微镜下观察。
1.5 Transwell检测细胞迁移情况
用Transwell 6孔细胞培养板铺板，对照组和ACOP组细胞分别在培养箱培养6、24、48 h，在下层小室中加入趋化剂（chemotaxis）。分别在不同时间点将小室用1×PBS洗2次，用刀片把小室穿透膜取下来放在载玻片上（把有透过细胞的那面朝上放，便于染色），把贴有小室穿透膜的载玻片用4%的多聚甲醛固定20 min，1×PBS洗3次，5 min/次，用0.1% Trition×-100透化细胞15 min，1×PBS洗3次，5 min/次，加100 μL苏木精染色20 min，自来水洗2 min，再用新的自来水浸泡10 min反蓝，用中性树胶封片，镜检。
1.6 统计学方法
采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 OPCs细胞鉴定
采用免疫细胞荧光方法，分别用原代培养NG2和PDGF-α标记OPCs细胞，GFAP标记星形胶质细胞，CD11b标记小胶质细胞。结果显示：OPCs细胞突起为双极，少数为3极或多极，不表达GFAP和CD11b，OPCs纯度达95%以上（图1）。
2.2 Transwell检测OPCs的迁移
对照组迁移到小室穿透膜上的OPCs细胞数量自6 h到48 h逐渐增多，而ACOP组迁移的OPCs细胞数量逐渐减少（图2）。与对照组比较，ACOP组迁移到小室穿透膜上的OPCs细胞数量在6 h开始下降，差异无统计学意义（P > 0.05），在ACOP后24 h时迁移到小室穿透膜上的OPCs細胞数量明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05）；其中，在ACOP后48 h时迁移的OPCs细胞数量下降最显著（P < 0.01）（图3）。
3 讨论
短时间过量吸入或长时间高浓度暴露一氧化碳均可引发一氧化碳中毒，导致机体多系统损害，尤以脑组织损害危害最大[1]。ACOP经急救治疗后，往往存在数天至数周（2～60 d）的表现正常或基本正常的“假愈期”，再次出现精神意识、大脑皮层局部、锥体及锥体外系功能障碍为主要临床表现的神经精神症状，即DEACMP，发生率占重症ACOP的50%以上[2]。颅脑MRI+DTI研究表明，半卵圆中心是ACOP后CNS损害和DEACMP的最主要受累区域[3]。病理研究也显示，CNS脱髓鞘病变被认为是最常见的病理学表现之一，但其机制仍不清楚[4]。Kuroda等[5]研究发现，ACOP患者白质损伤，DEACMP患者的蛋白质代谢物出现异常，其中，胆碱化合物/肌酸比值升高、N-乙酰天门冬氨酸/肌酸比值降低，乳酸髓鞘相关蛋白升高，他们还发现乳酸峰值的出现提示预后不良。Li等[6]研究发现ACOP大鼠脑内髓鞘抑制蛋白Nogo、MAG、NgR1表达增高，提示一氧化碳中毒可导致CNS脱髓鞘。近年来，有关DEACMP髓鞘损伤机制的研究还包括缺血缺氧、微血栓、自身免疫反应、再灌注损伤、自由基、钙超载、一氧化氮介导的损伤、细胞凋亡和兴奋性氨基酸毒性等方面[7-15]，多数学者认为DEACMP的发生是多种因素共同作用的结果，但上述机制仍不能对其发生、发展给出满意的解释。
CNS髓鞘由少突胶质细胞（oligodendrocytes，OLs）的突起缠绕神经元轴突形成。在CNS，OLs细胞由OPCs分化而来。值得注意，在成年CNS中OPCs占全部神经细胞的5%～10%，并保持一定增殖、分化能力，能够分化为OLs、Ⅱ型星形胶质细胞和神经元，是成年CNS的髓鞘形成的主要来源[16]。OPCs在成熟脑内广泛分布，除具有增殖和分化潜能外，还具备一些特殊的电生理特性，Ge等[17]发现它们可以直接接受神经元的突触支配，且具有可塑性。大部分学者认为，OPCs最先发生于胚胎腹侧端脑区以及发育后期的室管膜下区（subventricular zone，SVZ），并由此不断迁移到灰质和白质区分化为成熟的OLs细胞[18]。生理条件下，成年大脑白质区的OPCs增殖和分化处于一种“相对平衡”状态；而在病理损伤下，如多发性硬化症、神经退行性疾病、脑卒中等疾病中，OPCs会被激活并不断在SVZ区增殖并“精准”迁移到受损脑区，分化成为OLs，发挥髓鞘损伤修复等多种功能[19]。在一氧化碳中毒细胞模型研究中也发现，OLs在ACOP发生后即出现凋亡、数量减少[20]。孙瑞佼等[21]研究发现ACOP后大鼠发生CNS脱髓鞘及OPCs损伤。
近年来，王晓虹等[22]建立了一氧化碳中毒OLs细胞模型，但关于一氧化碳中毒的OPCs细胞体外实验较少。本研究通过建立体外纯化培养OPCs的一氧化碳中毒模型，利用Transwell实验检测ACOP对OPCs迁移的影响。结果显示，ACOP后OPCs细胞迁移能力在ACOP后6 h开始下降，在24 h及48 h时细胞迁移明显降低（P < 0.05）；其中，在ACOP后48 h细胞迁移能力下降最显著，提示一氧化碳中毒时间越长，OPCs细胞迁移能力越弱，损伤CNS髓鞘的修复越差，发生DEACMP的可能性越大。
综上所述，一氧化碳中毒导致OPCs细胞迁移能力下降可能在ACOP后CNS损伤和DEACMP的发生、发展和预后中发挥重要作用，进一步阐明该机制可能对认识DEACMP及寻找更有效的治疗手段具有非常重要的意义。
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（收稿日期：2016-07-15 本文编辑：张瑜杰）