摘 要 对芥末精油-β-环糊精包合物的制备工艺及微结构和缓释特性进行研究。首先，通过以包合率及包合物产率的加权综合评分为考察指标，采用单因素和正交实验设计对制备工艺进行了优化；其次，分别采用扫描电镜和控制环境温湿度的方法研究了其微结构和缓释特性。最佳包合工艺条件为：芥末精油与β-环糊精比例1 ∶ 6，包合时间1.5 h，包合温度50 ℃，在此条件下，包合率为90.56%，包合物产率为87.22%；扫描电镜结果显示包合物呈均匀不规则的板状；包合物中芥末精油释放速率与环境相对湿度和温度密切相关。
关键词 芥末精油；环糊精；包合物；缓释
中图分类号 TS202 文献标识码 A
Abstract The preparation process， microstructure and release characteristics of mustard essential oil-β-cyclodextrin inclusion were studied. Firstly， the optimization of the preparation process was conducted with the guide of inclusion rate and product yield， based on the single factor and orthogonal experimental design； Secondly， the micro-structure was observed by scanning electron microscopy while release properties were studied under controlled temperatures and humidity. The optimum condition of inclusion process was as follows： 1 ∶ 6（ratio of mustard oil and cyclodextrin inclusion ratio）， 1.5 h（inclusion time）and 50 ℃（inclusion temperature）. The process could achieve inclusion rate of 90.56% and product yield of 87.22%. Results of scanning electron microscopy showed that the inclusion complex appears uniform and irregular in shape. Release rates of essential oil were directly correlated with relative humidity and temperature.
Key words Mustard essential oil；cylcodextrin；inclusion complex；controlled release
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.028
芥末精油是以黑芥子或者白芥子经榨取而得来，为日本料理、韩国料理的一种常用调味汁，具有浓烈刺鼻的挥发性辛辣味，其主要风味成分AITCs（异硫氰酸烯丙酯）的含量在90%以上[1]。有研究表明，当芥末精油空间浓度达到2 μL/L时，对果蔬采后病原菌灰霉菌（Botrytis cinerea）、链格孢（Alternaria alternate）、青霉菌（Penicillium citrinum）和炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporiodes）的抑制作用均达到100%[2]。0.005～0.010 mL/L芥末精油空间熏蒸处理，能明显抑制芒果炭疽病菌和蒂腐病菌在芒果果实上的生长，且在空间浓度0.05 mL/L以下芥末精油熏蒸24 h，芒果常温贮藏12 d对其食用品质没有明显的影响[3]。芥末精油壳聚糖复配液对蜜桔的腐败病原菌-指状青霉的最低抑菌浓度为0.025 μL/mL，最低杀菌浓度为0.075 μL/mL[1]。然而，尽管芥末精油对果蔬采后病原菌呈现良好的抑菌作用，其应用还存在着诸多不足，如挥发性强，不利于储存且不方便使用，同时使得抗菌作用时间短；稳定性差，芥末精油的主要成分异硫氰酸烯丙酯在酸性环境中相对稳定，在中性溶液中其能与水反应被分解，且分解速率与温度有关[4]；刺激性气味大，很多消费者并不能接受其强烈刺鼻气味。
环糊精是一类环状低聚糖，具有内疏水、外亲水的结构空腔，在水溶液中能与多种疏水化合物结合形成主/客体或超分子包合物。其与客体分子形成包合物之后，能改变客体分子的理化和生物特性[5]，如增加水溶性、稳定性，降低刺激性、毒性和副作用等。同时环糊精空洞大小适中，水中溶解度小，口服后在肠道中参与机体代谢，无蓄积作用，使用安全无毒，不会引起免疫反应，生产成本低，日本和美国已批准将β-环糊精作为包合材料应用于医药和食品工业[6-7]。文献报道也表明，各种精油经环糊精包合之后，增加了其有效成分的稳定性、抗微生物活性、抗氧化活性[8-10]。
本研究采用β-环糊精对芥末精油进行了微胶囊包合研究， 采用单因素和正交实验，以包合率及包合物产率的加权综合评分为考察指标，进行了制备工艺的优化研究，采用扫描电子显微镜，对包合物的结构进行了初步表征，采用了控制环境相对湿度与温度的方法，对包合物的缓释特性进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 芥末精油（Mustard essential oil）：淡黃色液体，购于河北省平乡县天邦调味食品有限公司；β-环糊精，购于上海源叶生物科技有限公司。
1.1.2 仪器与设备 ML204电子天平（美国Mettler Toledo公司）；UV1800紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；RCT磁力搅拌器（德国IKA公司）；DHg-9070A真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 芥末精油最大吸收波长的确定与标准曲线的绘制 将芥末精油稀释至一定浓度，在200～400 nm下进行紫外扫面，确定最大吸收波长，并制作标准曲线。
1.2.2 芥末精油-β-环糊精包合物的制备 参照Liang G等[11]报道的方法，进行芥末精油-β-环糊精包合物的制备。
1.2.3 芥末精油包合效率和包合物产率的综合评分
准确称取0.1 g包合物，置于干燥的具塞试管中，加入正己烷10 mL，3次萃取，合并萃取液，准确测量萃取液体积，于芥末精油最大紫外吸收波长处测定吸光值。根据芥末精油标准曲线，计算芥末精油-β-环糊精包合物的表面油含量。再准确称取0.1 g包合物，置于干燥的具塞试管中，加蒸馏水10 mL，再加入正己烷10 mL，置于80 ℃水浴加热20 min，间歇振荡萃取，吸出有机相，再加入正己烷10 mL，同上操作，重复3次，合并有机相，准确测量有机相体积，于芥末精油最大紫外吸收波长处测定吸光值。根据芥末精油标准曲线，计算芥末精油-β-环糊精包合物的总油含量。
按以下公式计算芥末精油的包合效率和包合物产率：
包合效率=1-（表面油/总油）×100%
包合物产率=包合物重量/（β-环糊精投入量+芥末精油）×100%
综合评分是包合效率和包合产率的综合评价，包合效率、包合物产率是包合物制备实验中重要的考察指标，因此采用加权综合评分法[12]进行比较。包合效率是衡量包合效果的重要指标，包合效率越高，包合效果越好，可作为包合工艺优化的主要指标，故将其权重系数定为0.6；包合物产率在大生产中也很有意义，在β-环糊精和挥发油投入量一定的情况下，产率越高，包合效果越好，为次要筛选指标，所以包合物产率的权重系数定为0.4。在各平行实验中，将包合效率和包合物产率中的最大值作为包合效率max和包合物产率max，其评分为 100 分，其他数据的评分据此进行相应的计算。计算公式为：综合评分=（0.6×包合效率/包合效率max+0.4×包合物产率/包合物产率max）×100。
1.2.4 芥末精油-β-环糊精包合工艺优化的实验设计
（1）芥末精油与β-环糊精的比例（mL/g）。在芥末精油与β-环糊精的比例（mL/g）为1 ∶ 2、1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 8、1 ∶ 10时，包合时间为1.5 h，包合温度为40 ℃条件下，考察芥末精油与β-环糊精的比例对包合效率和包合物产率的影响。
（2）包合时间。分别在包合时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h时，芥末精油与β-环糊精的比例为1 ∶ 6，包合温度为40 ℃条件下，考察包合时间对包合效率和包合物产率的影响。
（3）包合温度。分别在包合温度为30、40、50、60、70 ℃，芥末精油与β-环糊精的比例为1 ∶ 6时，包合时间1.5 h条件下，考察包合温度对包合效率和包合物产率的影响。
（4）正交实验设计。根据单因素实验，得到各单个因素的适宜水平，以包合效率和包合物产率为指标，采用L9（34）正交实验表对包合工艺进行优化，考察芥末精油与β-环糊精的比例、包合时间、包合温度3个因素对芥末精油包合的影响，因素与水平表见表1。
（5）芥末精油-β-环糊精包合物表征。采用扫描电子显微镜分别对β-环糊精粉末、在最优工艺条件下制得的包合物进行观察，加速电压为15 kV。
（6）芥末精油-β-环糊精包合物的控释特性。参照Shiga H等[13]报道的方法，并稍加修改。在不同环境湿度和不同温度下，对芥末精油-β-环糊精包合物的控制释放进行检测。
1.3 数据处理
采用SPPSS19.0软件进行数据分析，结果用“平均值±标准偏差”表示，在p=0.05水平上比较差异显著性。
2 结果与分析
2.1 芥末精油最大吸收波长确定与标准曲线
芥末精油溶液紫外光扫描显示，其最大吸收波长为249 nm。所以选择249 nm为芥末精油测定波长。精确配制0.01～0.07 L/mL系列芥末精油的正己烷标准溶液，于249 nm处测定吸光值回归方程 y=11.0x+0.0887 [x：芥末精油浓度（L/mL），y：吸光度（A）]，相关系数R2=0.997 0。
2.2 单因素实验
2.2.1 芥末精油与β-环糊精的比例（mL/g）的影响
如表2所示，当芥末精油与β-环糊精比例逐渐减小，包合效率和包合物产率也逐渐上升，当其比例为1 ∶ 6时，包合效率和包合物产率最大，分别为90.95%和87.03%，当芥末精油与β-环糊精比例继续减小时，产率反而降低，可能原因是β-环糊精的空腔容量有限，当其用量增大时，形成的包合物几率也增大，但用量过大时，有一部分β-环糊精未参与反应，包合物产率反而下降。芥末精油与β-环糊精为1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 8时，综合评分较高，选择进行正交试验。
2.2.2 包合时间的影响 由表3可以看出，包合效率和包合物产率随着包合时间延长而升高，当包合时间为1.5 h时，包合率和包合物产率达最大值，当包合时间超过1.5 h时，二者反而下降。其可能原因是包合反应是可逆过程，反应开始时，包合反应速度大于解包合反应速度，因此包合产物不断增加。随着时间的延长，包合与解包合速度逐渐平衡，生成包合产物的量趋于稳定，包合物產率也趋于稳定，再增加包合时间包合效率反而会因为部分已生成的包合物解包合而有所下降。包合时间为1、1.5、2 h时，综合评分较高，选择进行正交试验。
2.2.3 包合温度的影响 由表4可以看出，当温度达50 ℃时，包合效率和包合物产率均达到最大值，温度继续上升，包合率呈现下降趋势。可能原因是温度升高时，有利于β-环糊精的溶解，可使包合效率和包合物产率增大，当温度过高时，芥末精油易挥发，且其主要成分异硫氰酸烯丙酯越容易被分解，反而使包合效率和包合物产率均下降。因此，最佳包合温度为50 ℃。包合温度40、50、60 ℃时，综合评分较高，选择进行正交试验。
2.3 正交实验
由表5、6可知，芥末精油与β-环糊精的比例为1 ∶ 6，包合时间为1.5 h，包合温度60 ℃时，综合评分最高，根据极差大小判断，影响芥末精油与-β-环糊精包合因素大小依次是：芥末精油与β-环糊精的比例>包合时间>包合温度；方差分析表明，精油与β-环糊精的比例对包合影响最大，其次为包合时间和包合温度，与表4做出的判断结果一致。
2.4 最优包合工艺的验证实验
由于正交实验无最佳水平组合，芥末精油与β-环糊精比例1 ∶ 6，包合时间1.5 h，包合温度50 ℃，因此需要对其进行验证，结果表明，在最佳水平组合条件下，包合率为90.56%，包合物产率为87.22%，均高于正交实验中的5号实验。此结果表明，优化得到的最佳水平组合可靠有效。
2.5 包合物的微结构观察
由图1可见，β-环糊精为透明或半透明、形状不规则的、板状的较大晶体，芥末精油-β-环糊精包合物呈均匀不规则的板状，表面光滑、无孔洞、无裂纹。
2.6 芥末精油-β-环糊精包合物的控释特性
2.6.1 不同湿度下芥末精油-β-环糊精包合物的控制释放 由图2可知，在25 ℃，一定的环境相对湿度下，芥末精油-β-环糊精包合物都具有释放特性，且环境湿度越大，释放速度越快。贮藏初期，包合物中包合油的含量为67.57 L/g，在不同环境相对湿度下（50%、75%、98%）放置24 h后，芥末精油的残留率就呈显著性差异（p<0.05），分别降至78.7%、64.2%、55.5%。随着贮藏时间的延长，释放速度逐渐平缓，120 h后，芥末精油的含量分别为39.93、31.42、25.34 L/g。环糊精的包埋和释放，都需要水分的参与，即是一个环糊精包合物中客体与水分子相互替换的过程，因此环境中水分含量对包合物中客体的释放具有绝对性的作用[14]。
2.6.2 不同环境温度下芥末精油-β-环糊精包合物的控制释放 由图3可知，当环境相对湿度为98%时，温度越高，芥末精油-β-环糊精包合物的释放速度越快，24 h后，不同环境温度下芥末精油的残留率就呈显著性差异（p<0.05），120 h后，芥末精油分别有原来的67.57 L/g降至49.66、42.50、34.53 L/g。因此，低温环境有利于芥末精油-β-环糊精包合物的贮藏。
3 讨论
依据食品添加剂使用标准（GB2760-2014），芥末提取物-芥末精油是允许使用的食品用天然香料之一[15]。芥末精油及其主要成分异硫氰酸烯丙酯[16]因其天然性及良好的抑菌性能获得广泛关注，同时通过微胶囊化掩盖其刺激性气味并实现精油的缓释控制也有较多研究[17-19]。目前，精油与环糊精包合制备包合物的方法主要有：研磨法、喷雾干燥法、溶液法。研磨法费力费时，仅限小量进行；喷雾干燥法产率高，但只适合热稳定性较高的精油[20]。溶液法具有操作简单、操作温度适中且过程容易控制等特点，因此容易实现放大生产。主要成分异硫氰酸烯丙酯在中性溶液中能与水反应并被分解，且分解速率与温度有关[4]，因此，本研究选择了溶液法对芥末精油进行微胶囊化。
本研究发现，影响芥末精油-β-环糊精包合物包合效率和包合物产率的主要因素有芥末精油与β-环糊精的比例、包合时间、包合温度。芥末精油与β-环糊精的比例较大时，芥末精油不能完全进入β-环糊精被其包合；比例较小时，又会导致β-环糊精的浪费。实验结果表明芥末精油-β-环糊精包合物的最佳包合工艺为：β-环糊精与芥末精油比例为6 ∶ 1（g/mL），包合时间为1.5 h，包合温度为50 ℃。在此条件下，包合率为90.56%，包合物产率为87.22%，该制备工艺稳定可靠，重现性良好。文献报道异硫氰酸烯丙酯的最佳包合工艺为：β-环糊精与异硫氰酸烯丙酯的比例为5 ∶ 2（g/mL），包合时间为5 h，包合温度为20 ℃。在此条件下，包合率为36.25%，包合物产率为71.56%[18]。两个实验结果相差甚大，原因可能是文献中包合温度过低导致β-环糊精的溶解度较小造成包合时间过长，进而导致造成芯材的挥发损失[21]。包合时间、包合温度，在实验室层面很容易实现精确控制，但大规模生产时应在不影响包合效率和包合物产率的前提下，尽量减少包合时间和降低包合温度并减少用水量，从而实现包合效果与能耗的兼顾。
本研究扫面电镜结果显示芥末精油包合物呈不规则的板状， 但相比环糊精，颗粒更均匀。而Liang 等[11]同样通过扫描电镜发现丁香酚与β-环糊精包合后颗粒更小且大小更均一，同时，通过核磁共振等手段证实客体分子包合进主体分子后化学位移发生了变化。控释试验发现，环境相对湿度越大或环境温度越高，芥末精油-β-环糊精包合物释放速率越大。这是由于环糊精与客体形成包合物之后，其客体分子的释放均需水分子的参与，即环糊精空腔中客体分子与水分子相互替代过程，环境水分含量（即相对湿度）对包合物中客体的释放具有决定性作用。同时，水分子与客体分子的替代过程属于吸热反应，高温不利于包合物的稳定[22-23]。因此，芥末精油-β-环糊精包合物应密封且适温贮藏。
微胶囊化在食品工业应用很广泛，在保鲜领域也有极成功的案例，如1-MCP（1-甲基环丙烯）通过微胶囊化从而实现商业化生产并大范围应用。芥末精油等植物精油的微胶囊化还有系列后续研究需要跟进，如其贮存条件需更精確、如何在少数极端条件下维持微胶囊化产品的稳定性、不同保鲜对象需求的植物精油释放速度不一样（依其耐受性及货架期长短）而需对微胶囊化产品进行个性化设计等。
参考文献
[1] 费湘伟， 桑卫国. 芥末油壳聚糖复配对蜜桔采后病原菌的抑制作用研究[J]. 食品工业科技， 2013， 34（20）： 340-343.
[2] 张 娜， 关文强， 李春媛. 芥末精油对果蔬采后病原菌抑制效果的研究[J]. 保鲜与加工， 2008， 8（6）： 39-41.
[3] Nielsen P V， Rios R. Inhibition of fungal growth on bread by volatile components from spices and herbs and the possible application in active packaging with special emphasis on mustard essential oil[J]. International Journal of Food Microbiology， 2000， 60： 219-229.
[4] 姜子涛， 张清峰， 李 荣， 等. 异硫氰酸酯的产生、化学性质及测定方法[J]. 中国调味品， 2005（4）： 9-16.
[5] 童林荟. 环糊精化学[M]. 北京： 科学出版社， 2001.
[6] Szejtli J. Past， present， and future of cyclodextrin research[J]. Pure Applied Chemistry， 2004， 76（10）： 1 825-1 845.
[7] E M Martin Del Valle. Cyclodextrins and their uses： a review[J]. Process Biochemistry， 2004， 39： 1 033-1 046.
[8] Arana-Sánchez A， Estarrón-Espinosa M， Obledo-Vázquez E N， et al. Antimicrobial and antioxidant activities of Mexican oregano essential oils （Lippia graveolens H.B.K.） with different composition when microencapsulated in beta-cyclodextrin[J]. Letters Applied Microbiology， 2010， 50（6）： 585-590.
[9] Kfoury M， Auezova L， Greige-Gerges H， et al. Cyclodextrin， an efficient tool for trans-anethole encapsulation： chromatographic， spectroscopic， thermal and structural studies[J]. Food Chemistry， 2014， 164： 454-461.
[10] Hill L E， Gomes C， Taylor T M. Characterization of beta-cyclodextrin inclusion complexes containing essential oils （trans- cinnamaldehyde， eugenol， cinnamon bark， and clove bud extracts） for antimicrobial delivery applications[J]. LWT-Food Science Technology， 2013， 51（1）： 86-93.
[11] Liang G， Taotao L， Feng C， et al. An inclusion complex combined eugenol into β-cyclodextrin： preparation， physicochemical and antifungal characterization[J]. Food Chemistry， 2016， 196： 324-330.
[12] 胡良平. 現代统计学与SAS应用[M]. 北京： 军事医学科学出版社， 2000.
[13] Shiga H， Yoshii H， Nishiyama T， et al. Flavor encapsulation and release characteristics of spray-dried powder by the blended encapsulant of cyclodextrin and gum arabic[J]. Drying Technology， 2001， 19（7）， 1 385-1 395.
[14] 钱亮亮， 金征宇， 邓 力. 密封控温法制备控释材料肉桂醛-β-环糊精包合物[J]. 食品与发酵工业， 2007， 33（12）： 13-16.
[15] GB2760-2014 食 品 添 加 剂 使 用标准[S]. 2014-12-24.
[16] 张 娜， 关文强， 李春媛. 芥末精油对果蔬采后病原菌抑制效果的研究[J]. 保鲜研究， 2008， 8（6）： 39-41.
[17] Ko J A， Kim W Y， Park H J. Effects of microencapsulated Allyl isothiocyanate（AITC） on the extension of the shelf-life of Kimchi[J]. International Journal of Food Microbiology， 2012， 153： 92-98.
[18] Lee H L， Kang H A， Kim K H， et al. Microencapsulation effect of Allyl isothiocyanate with modified starch using fluidized bed processing[J]. Food Science and Biotechnology， 2009， 18（5）： 1 071-1 075.
[19] 霍建华， 曹小妹， 邓一蕾， 等. 异硫氰酸烯丙酯的包结工艺研究[J]. 中国食品添加剂， 2009， 6： 143-149.
[20] 曹新志， 金征宇. 环糊精包合物的制备方法[J]. 食品工业科技， 2003， 20（14）： 158-160.
[21] Zhou S S， Wang L M， Zhang A P， et al. Preparation， stabilization， and bioefficacy of beta-cyclodextrin inclusion compounds of chloramidophos[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2008， 56（8）： 2 708-2 713.
[22] 李学红， 金征宇. 异硫氰酸烯丙酯的分子包埋物在不同温度下的控制释放[J]. 食品科学， 2007， 28（3）： 139-142.
[23] 钱亮亮， 金征宇， 邓 力. 密封控温法制备控释材料肉桂醛-β-环糊精包合物[J]. 食品与发酵工业， 2007， 33（12）： 13-16.