【摘 要】 目的：观察加味通幽汤对缺氧导致的食管癌细胞血管生成拟态（VM）形态学和细胞增殖的影响。方法：缺氧环境培养Eca109细胞，镜下观察细胞VM，以加味通幽汤含药大鼠血清干预细胞，观察其对VM形态的影响，CCK8法检测方药对细胞增殖的影响。结果：常氧对照组细胞形态成团状且无规律；含药血清常氧组细胞分散，出现凋亡；缺氧对照组细胞相互连接呈管状；含药血清治疗组细胞成团块状并且出现凋亡。CCK8细胞增殖实验显示，含药血清治疗组明显低于其他3组（P=0.000）。结论：加味通幽汤可改善食管癌细胞VM形态变化，并抑制缺氧环境下的细胞增殖。
【关键词】 食管癌；Eca109细胞；加味通幽汤；血管生成拟态
【中图分类号】R-332 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2018）08-0023-04
Abstract：Objective To observe effectof Modified Tongyou Decoction （MTD） onvasculogenic mimicry （VM） morphology and cell proliferation of esophageal squamous carcinoma cellunder hypoxic conditions.Methods Eca109 cells were cultured in hypoxia environment， vasculogenic mimicry was observed through microscope. Rats’ serum with MTDwas taken into culture medium， VMmorphology was observed and cell proliferation was determined with CCK8 assay.Results Cells in the controlled group shape of cells were colony and irregular； cells were scatteredin the medicated-serumcontrolled group， apoptosis emerging； however， cells were connected with each other in hypoxia group cell with fusion of tubulous structure； cells in the medicated-serum treatment group were mass clumps and apoptosis also occurred. Proliferation ratio in the medicated serum treatment group was significantly lower than that in the other 3 groups（P=0.000）.Conclusion Under hypoxia conditions，MTD shows significant effect on VM andproliferationof Eca109 cells .
Keywords：Esophageal Cancer； Eca109 cell； Modified Tongyou Decoction； Vasculogenic Mimicry
在世界范围内，我国的食管癌发病率和死亡率均位居各国之首。我国的食管癌病理类型以鳞癌为主，约占食管癌总数的95%左右。食管鳞癌具有进展迅速、早期转移等特点，绝大多数患者在发现时已处于中晚期，局部复发和远处转移较多，总体预后较差，严重危害人们健康[1-3]。1999年，Maniotis 等在对人眼葡萄膜黑色素瘤的研究中发现了血管生成拟态（vasculogenic mimicry， VM），血管生成拟态是对传统肿瘤血管生成理论的补充。肿瘤增生过快造成肿瘤微环境始终处于相对缺氧和代谢紊乱状态，这是恶性肿瘤的生长特点之一。研究表明缺氧可触发机体产生一系列应激性保护反应。肿瘤细胞在没有内皮细胞的参与下，表型出现转化，通过自身变形和基质重塑直接形成特有的微循环管道，这种管道能够执行微血管功能，部分弥补了因为血管新生滞后于瘤体生长所造成的氧和营养供给的缺乏，促进肿瘤迅速增长[4-7]。
食管癌在中医属于“噎膈”范畴，“金元四大家”之一李东垣所著《兰室秘藏》记载有“通幽汤”，是治疗瘀血内结，浊气不降之噎膈[8]的代表方，笔者结合中药药理研究成果[9-14]，创制加味通幽汤，获得国家发明专利（ZL201110308544.0），全方由桃仁、红花、升麻、槟榔、半枝莲和白花蛇舌草6味中药组成。方中活血化瘀药桃仁、红花与行气散结药升麻、槟榔抑瘤效果显著；半枝莲、白花蛇舌草中含有的黄酮类、总多糖、皂苷等具有显著的抑瘤和促凋亡作用，临床广泛应用于包括食管癌在内的多种实体肿瘤。本研究观察了加味通幽汤对缺氧条件下食管癌Eca109细胞VM形态和细胞增殖的影响。
1 材料
1.1 动物及细胞株 4～6周龄SD雄性大鼠，体重200～400 g，清洁级，购于中国人民解放军军事医学科学院动物实验中心，合格证号SCXK-（军）2014-0001。人食管癌 Eca109 細胞株购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。
1.2 药物与试剂 加味通幽汤（桃仁5 g，红花15 g，升麻10 g，槟榔5 g，半枝莲15 g，白花蛇舌草15 g），各单味药物均购于北京同仁堂唐山连锁药店。
新生牛血清（GIBCO公司），胰蛋白酶（GIBCO公司），1640培养基（CORNING公司），PBS缓冲液（BI公司），10%水合氯醛，Matrigel胶，CCK8（Amersco公司），10×CoCl2（Sigma公司），Milli-Q水（Milli-pore公司Milli-Q超纯水设备生产）。
1.3 仪器与材料 96孔细胞培养板（美国Corning公司）； 24孔细胞培养板（美国Corning公司）； 细胞培养瓶（美国Corning公司）； 移液管（gibcol公司）； 离心管（gibcol公司）； 3MK型低温高速离心机（美国Sigma公司）； 1100型无菌超净台（美国Forma公司）； 3366型CO2培养箱（美国Forma公司）； TMD-2倒置式显微镜（日本Nikon公司）； NOVAPATH 450型酶标光度计（美国Bio-Tek公司）。
2 方 法
2.1 方药制备 加味通幽汤加入30倍体积的水，浸泡30 min，武火煮沸，文火煎煮40 min，收集药液，入烧杯中浓缩方药至200 mL，-20℃冻存，用时调至所需浓度。
2.2 大鼠血清制备 4～6周龄SD大鼠40只，将其随机分为两组（对照组15只，含药组25只），对照组和含药组分别灌胃0.9%的生理盐水和加味通幽汤。调整加味通幽汤浓度：以标准成人用量为基础，按照大鼠体表面积与人体换算系数，计算大鼠所需生药量（14.2mg/mL），以Milli-Q水调整药液浓度。
两组大鼠灌胃量均为1mL/d，连续灌胃14 d。最后1次灌胃后12h，腹主动脉取血，离心后取上层血清。将提取到的血清56℃恒温水浴灭活加热30 min后，在超净台中用针式滤器（0.22μm）过滤除菌，放入EP管中，-80℃冷冻保存备用。
2.3 细胞培养及种板（96孔） 以含有10%的FBS和1%的双抗1640培养基10 mL接种Eca109细胞于100 mm2培养皿中，待其生长至对数期，PBS冲洗后用0.25%胰酶消化，离心反复吹打成单细胞悬液，细胞密度10000个/mL，每孔接种150μL的悬液，培养1 d。
2.4 细胞形态观察 24孔板每孔加入300μL Matrigel胶（冰上操作），置于培养箱30min使其凝固，每孔给予1000μL各实验组单细胞悬液，培养1d。倒置显微镜（×200）下观察拍摄细胞形态。
2.5 CCK8细胞增殖实验 取出96孔板，弃培养基。实验分为A组（对照组）、B组（缺氧组）、C组（含药血清对照组）、D组（含药血清治疗组）。A组： 10%对照大鼠血清、90%1640空白培养基；B组： 10%对照大鼠血清、10%10mmol/L的CoCl2缺氧诱导液和80%1640空白培养基；C组：10%含药大鼠血清、90%1640空白培养基；D组：10%含药大鼠血清、10%10mmol/L的CoCl2缺氧诱导液和80%1640空白培养基。每孔分别加入各组所需培养基100μL，每组设3个复孔。培养1d后，每孔加入10μL的CCK8，培养2h，酶标仪450nm处测OD值。
2.6 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件进行分析，组间差别显著性检验采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 加味通幽汤对细胞血管生成拟态的影响 4组培养24 h后形态发生明显变化。镜下观察，对照组Eca109细胞成团块状生长，无明显规律。缺氧组细胞则相互连接，成单条或多条管状结构。在给药后细胞都发生了凋亡。含药血清对照组细胞分散无规律，而含药血清治疗组细胞聚集成团状或条索状没有出现管状结构。如图1所示。
3.2 加味通幽汤对缺氧条件下细胞增殖的影响 本实验给予加味通幽汤刺激后，各组间Eca109细胞增殖出现明显差异（如图2所示）。与对照组相比，Eca109细胞给予CoCl2处理后，细胞活性明显降低，此差异具有统计学意义（P=0.000）。Eca109细胞给予含药血清处理后与对照组相比，细胞活性无明显变化（P=0.867）。然而，CoCl2刺激Eca109细胞后给予含药血清治疗，细胞活性与含药血清对照组和缺氧组相比，细胞活性均有所下降，此差异均具有统计学意义（P=0.000）。提示加味通幽汤进一步抑制缺氧诱导的Eca109细胞活性。
4 讨论
食管癌是临床常见的恶性肿瘤，我国是其高发区[15]，约占全球的50%，同时也是死亡率最高的国家[16]。中医理论认为其重要病机是内伤饮食、情志不遂互为因果[17]。陈无择在《三因极一病证方论·卷八》中指出：“喜怒不常，忧思过度，恐虑无时，郁而生涎，涎与气搏，升而不降，逆害气滞……与五膈同，但此在咽嗌，故名五噎”，说明忧思郁怒导致气机郁滞，气滞或津停生痰，或瘀血内生，交阻于食道，妨碍饮食。古今医家认为恶性肿瘤患者体内血行不畅、瘀血内停，现代临床也证实了血瘀是肿瘤形成发展的主要病理机制。故治疗当以活血祛瘀、行气散结。本实验所使用的加味通幽汤由白花蛇舌草、半支莲、升麻、槟榔、桃仁、红花组成，其中桃仁、红花活血祛瘀；半支莲、白花蛇舌草可解除体内之瘀毒；槟榔下行而破气滞，升麻升清而降浊阴，一升一降，胃气乃通。全方紧扣食管癌的病机，以行气、活血、祛瘀、滋养阴血为主要功效。
恶性肿瘤的存活和生长离不开血液供应，肿瘤细胞可以在缺氧情况下模拟血管内皮细胞形成一种功能上类似于正常血管的通道，形成另一种肿瘤供血系统，这种血供不需要内皮细胞的参与，但其内部含有红细胞和血浆，并且还可以与常规的内皮血管相沟通，构成血液输送网络，即血管生成拟态。血管生成拟态在包括食管癌在内的多种肿瘤发生、发展、浸润和转移过程中有重要的作用，并且与肿瘤的恶性程度密切相关。恶性程度高的肿瘤才能形成VM，而低度的恶性肿瘤不能形成，这是因为恶性程度高的肿瘤生长迅速，更容易形成缺氧的微環境；另一方面恶性浓度高的肿瘤分化差，肿瘤细胞的多能性高，遂能够模拟内皮细胞并具备相应的功能。由于VM的结构特殊，使肿瘤细胞与血流之间的屏障减弱，容易脱落随血液运输而转移，从而增高了癌转移的几率。
本实验VM形态学观察显示，对照组Eca109细胞呈团块状聚集生长，给药后的含药血清对照组使细胞分散并出现凋亡。在给予缺氧诱导后，细胞恶性程度加重，形成了VM管道以获得足够的氧气。含药血清治疗组的细胞虽呈现团块聚集生长但是未出现VM，并且呈现不同程度的凋亡。说明加味通幽汤对Eca109细胞血管生成拟态的形成起到了显著的抑制作用。
恶性增殖是肿瘤细胞最主要的特征，不断增多的肿瘤细胞导致耗氧量增加，造成肿瘤内部缺氧微环境，促进VM形成，增加细胞氧供，从而形成“细胞增殖-缺氧-VM-再增殖”的循环，而未发生VM的区域常伴随细胞缺氧凋亡。本研究CCK8实验结果显示，对照组和含药血清对照组细胞活性无差异，缺氧组和含药血清治疗组细胞活性明显低于相应对照组，提示缺氧导致细胞活性降低；另外，含药血清治疗组细胞增殖低于缺氧组，说明缺氧的Eca109细胞对加味通幽汤更敏感，加味通幽汤进一步抑制缺氧组细胞活性，影响其形成VM。
本研究表明加味通幽汤对食管癌的Eca109细胞VM形成有显著抑制作用，对Eca109细胞有促进凋亡的作用，但临床应用还需进一步研究。
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（收稿日期：2018-02-05 编辑：刘 斌）