[摘要]为探索金铃子散在治疗炎症过程中对生物体内炎症机制的调节作用，该研究采用了核磁和液质联用技术，将各组大鼠血清样本采用1HNMR和LCMS联用的代谢组学分析方法，通过分析角叉菜胶致大鼠足肿胀模型中不同组别炎症大鼠体内代谢物差异的变化，发现并筛选与炎症模型相关的生物标记物，从而推测金铃子散对角叉菜胶致炎的调节机制。通过分析相关数据结果，筛选出与炎症相关的差异性代谢物有18个：鸟苷、9顺视黄酸、三磷酸、肌苷5′磷酸、二磷酸肌苷、三聚磷酸盐、无机磷酸、甘油磷酸胆碱、21脱氧皮质醇、柠檬酸、谷氨酸、琥珀酸、赖氨酸、牛磺酸、丙酮酸、苹果酸、2酮戊二酸、甘氨酸等。相关的代谢通路有柠檬酸循环（TCA循环），乙醛酸和二羧酸代谢，甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢，丙酮酸代谢。从代谢网络图显示金铃子散在调节机体内炎症方面，可通过调节柠檬酸，琥珀酸，甘氨酸的含量，进而减少氧自由基攻击程度，降低细胞的损伤，从而下調机体组织产生炎性因子起到抗炎的作用。
[关键词]金铃子散； 抗炎； 代谢组学； 液质联用
Antiinflammation effect of Jinlingzi San in rat metabonomics based on
1HNMR and LCMS technology
SHEN Shujie1， SHUI Sufang2， XIAO Bingkun1， YANG Jianyun1， HUANG Rongqing1， 2*
（1 Institute of Radiation Medicine， Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100850， China；
2 Anhui Medical University， Hefei 230032， China）
[Abstract]To further explore the regulatory effect of Jinlingzi San on in vivo inflammatory mechanism during inflammatory treatment， this study adopted 1HNMR and LCMS technology to analyze differences in in vivo metabolites of carrageeninduce rat foot swelling model Besides， biomarkers related to inflammation models of Jinlingzi San in SD rats were discovered to speculate the regulatory mechanism of Jinlingzi San in resisting carrageeninduce inflammation Through the analysis of detection spectrum， we found 18 biomarkers of metabolites（citrate， pyruvate， malic acid， succinate， glutamate， lysine， tartrate， 2oxobutyric acid， glycine， guanosine， 9cisretinoic acid， triphosphate， inosine 5′diphosphate， inosine diphosphate， tripolyphosphate， inorganic triphosphate， glycerophosphocholine， 21deoxycortisol） Relevant pathway analysis results were TCA cycle， pyruvate metabolism， glycine， serine and threonine metabolism， and dicarboxylic acid metabolism From the metabolic network， we can see that the antiinflammatory effect of Jinlingzi San can regulate citric acid， succinic acid and glycine content to resist oxygen free radical and reduce body damage by ROS， so as to dowegulate inflammatory factors generated from body tissues and resist inflammation.
[Key words]Jinlingzi San； antiinflammation； metabonomics； LCMS
炎症是机体对于外界刺激的一种防御性反应，通过炎症充血和渗出，包围和杀伤损伤因子，与此同时实质和间质细胞的再生功能可使受损的细胞组织得以修复和愈合 [13]。目前相对孤立的研究方法很难监测到机体全面动态的变化，而基于系统和整体水平的代谢组学研究，可以对外界因素所引起的代谢物质，随时间和空间的变化所致动态多参数分析[4]，通过研究与疾病相关的差异性代谢物，可从整体水平上揭示炎症的相关生物学机制。
目前，中医中药的抗炎药理研究成为中医药现代研究较为活跃的领域。由延胡索和川楝子组成的金铃子散，其在治疗胃炎、胃溃疡等疾病方面疗效尤其显著[5]。角叉菜胶诱导大鼠足肿胀的急性非特异性的炎症模型，与血管活性物质激肽类一起诱发水肿、出血等病理反应，通过前列腺素来诱导产生多种炎性介质的释放，包括5羟色胺（5HT）、组胺、氧自由基等[6]。本研究利用核磁共振波谱法和液质联用代谢组学技术寻找大鼠炎症模型体内的差异性表达代谢物，并对所得的实验数据进行代谢轨迹分析和代谢网络富集。通过这些途径深入研究金铃子散对角叉菜胶所致大鼠炎症的代谢调控，以期寻找潜在重要分子靶标和揭示其作用机制。
1材料
11仪器Agilent 1200/6410三重串联四级杆液质联用系统，配有在线脱气系统（G1322A）、二元泵（G1312B）、自动进样器（G1367E）、柱温箱（G1316A）、VWD 检测器（G1314A）、电喷雾离子源（G6410B），美国安捷伦科技有限公司；Varian UNITY INOVA600型超导傅里叶变换核磁共振谱仪，美国瓦里安公司；大鼠不锈钢代谢笼，北京龙东海科研设备制造有限公司；TGL16B台式离心机，上海安亭科学仪器厂；VictorX5酶标仪，美国PerkinElmer公司；LGJ25C冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂。
12试剂09%生理盐水，石家庄四药有限公司；戊巴比妥钠，北京化学试剂公司，德国进口分装；叠氮化钠（NaN3），英国 Alfa Aesar化工有限公司；磷酸二氢钠（NaH2PO4，纯度≥990%）、磷酸氢二钠（Na2HPO4，纯度≥990%），美国Sigma 化工有限公司；重水（D2O，光谱纯），美国 CIL 有限公司；5 mmol·L-1 DSS内标液（光谱纯，pH=730），加拿大Chenomx有限公司；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯），比利时 Fisher 试剂有限公司；纯化水，屈臣氏（集团）有限公司；甲酸（Fluka，50%水溶液，色谱纯），美国 SigmaAldrich化工有限公司。
金铃子散（延胡索，北京同仁堂责任有限公司，批号404002248P；川楝子，北京同仁堂责任有限公司，批号101152286W）；角叉菜胶（Sigma 公司，批号1001809743）；阿司匹林（Bayer HealthCare Manufacturing Srl，批号BJ10205）。
13动物雄性SD大鼠30只，由军事医学科学院实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（军）20120004，体重（200±20） g，所有大鼠均在单一代谢笼内饲养。温度（23±1） ℃，12 h光/暗循环（光照时间8：00—20：00），自由进食饮水。昆明种雄性小鼠，体重（20±12） g，购自军事医学科学院实验动物中心，动物许可证号SCXK（军）20120004，所处实验环境与大鼠相同。
14金铃子散水煎液的提取金铃子散 （川楝子和延胡索各1 000 g），加10倍量水浸泡后，煎煮1 h，用医用纱布过滤，加8倍量的水进行第2次煎煮浓缩，煮沸回流1 h，合并2次滤液，进行抽滤和减压浓缩，使药液浓缩成浸膏状，得450 mL药液，浓缩液和药材之比为1∶444 （相当于1 mL含生药444 g），4 ℃冷藏，备用。
2方法
21角叉菜胶致大鼠足肿胀实验模型将实验分组为金铃子散（低、中、高）实验组，空白模型组，阳性对照组。实验开始前将大鼠随机分组，每组6只，共30只，每天连续 5 min的抚摸适应7 d。金铃子散实验组（低、中、高剂量组）大鼠分别以（0147，0443，1329） g·kg-1剂量灌胃，阳性对照组给予阿司匹林50 mg·kg-1，等体积药液灌胃给药，且药液均用生理盐水配制，模型组给予等体积的生理盐水。给药14 d后，于大鼠右后跖足皮内注射1%角叉菜胶生理盐水溶液01 mL致炎，在各实验组大鼠的右后肢裸关节处作一标记，并于致炎后 0，120，180 min，用排水法分别测量右后足踝关节排水体积，并作为大鼠足肿脹程度的指标，以抑制率反映药物抗炎的作用强度[7]。大鼠致炎（3 h）后，每组大鼠分别于腹主动脉收集血液，至室温下静置10 min析出血清，12 000 r·min-1离心 10 min，取上层淡黄色透明血清，于-80 ℃保存。
沈淑洁等：基于1HNMR及LCMS技术研究金铃子散对炎症大鼠模型调节机制的影响22角叉菜胶模型大鼠血清核磁和液质数据采集由于血样易于采集，包含生物体的整体性代谢物信息，故本实验采集大鼠的血清进行检测。NMR测量前血样准备： -80 ℃冰箱中取出，于4 ℃解冻，以D2O稀释，加入5 mmol·L-1DSS内标溶液，制备得到含10 mmol·L-1DSS的测定溶液。将待测定的溶液离心10 min，取500 μL的上清液于5 mmol·L-1 NMR管中，进行NMR 数据采集。数据在Varian UNITY INOVA 600超导脉冲傅里叶变换核磁共振谱仪上进行采集。调用CPMG脉冲序列，参数如下：谱宽为8 000 Hz，傅立叶变换点为131 072，采样点数是64 000，线增宽因子为3，采样时间为4 s，累加次数64次，自旋扩散时间01 s，弛豫延迟时间为2 s。采用预饱和的方式抑制水峰，谱仪偏置设置在水峰的位置。自由感应衰减信号（FID）经过傅立叶转换后成为一维NMR谱图[8]。以DSS（δ设为0）为化学位移参考峰的位置，其中CPMG数据积分范围为02～54段，对这段区间内的核磁谱图按每段001的宽度进行分段积分。并且排除溶剂峰和尿素峰（δ 510～460）积分区段，将积分数据归一化后，利用SIMCAP 115软件包（瑞典，Umetrics AB，Umea）进行主成分分析。本实验中代谢物的谱峰归属主要是依据其化学位移值、峰的裂分以及参考相关文献报道，同时借助于软件Chenomx NMR Suite 71（Chenomx，Inc.，Edmonton，Alberta，Canada） 中代谢产物的自动解析功能。分析相关的差异性代谢物。
液质联用分析时，取100 μL解冻后血清加入 400 μL的乙腈沉淀蛋白，4 ℃下12 000 r·min-1离心15 min，移取上清液供 LCMS分析。以Agilent三重串联四级杆液质联用仪进行数据采集：使用HP ODS C18 Hypersil色谱柱，流动相为01%甲酸溶液（A）乙腈（B），梯度洗脱，0～5 min，5%～60%B，5～7 min，60%～75%B，7～10 min，75%～90%B，10～11 min，90%～80%B，11～22 min，80%～75%B，22～25 min，75%～30%B，25～28 min，30%～5%B，流速03 mL·min-1；进样量20 μL；柱温30 ℃；VWD检测波长254 nm。质谱条件：采用正、负离子MS2扫描模式进行数据采集，以MassHunter软件进行数据处理。质谱数据采集参数：正、负离子化模式，干燥气温度350 ℃，雾化器压力50 psi（1 psi=6895 kPa），干燥气流速10 L·min-1，毛细管电压（+）4 000 V，（-）3 500 V，Fragmentor135 V，扫描范围m/z 50～1 000，Delta EMV （+）200 V，（-）250 V。
23数据处理将液质联用采集到的数据上传至XCMS数据处理平台进行质谱特征离子评估。通过XCMS分析结果对峰值保留时间偏差进行质控评价，提取组间差别较大的化合物信息（P<005），并根据平台生成的PCA结果，筛选多元统计分析中变异最大的9个化合物，分别为鸟苷、9顺视黄酸、三磷酸、肌苷5′磷酸、二磷酸肌苷、无机磷酸、甘油磷酸胆碱、21脱氧皮质醇、三聚磷酸盐。通过匹配在线的质谱数据库，对化合物进行鉴定并验证结果的正确性。结合核磁谱图分析得到的9个差异性代谢物（柠檬酸、丙酮酸、苹果酸、琥珀酸、谷氨酸、赖氨酸、牛磺酸、2酮戊二酸、甘氨酸）上传到 MetPA 数据处理中心，通过与 KEGG 数据匹配ID后，进行通路富集和网络构建。以Fishers正确性检验和超几何分布检验对数据在特定生物途径中的随机性进行测试。根据得到的MetPA预测数据，进行代谢机制预测和解释。
大鼠的足肿胀度采用SPSS 170软件进行单因素方差分析，并进行组间样本方差分析（ANOVA），通过方差分析中的LSD和SNK法对样本组间差异情况进行分析。以P<005表示组间有明显统计学差异，P<001表明组间有极明显统计学差异。
3结果
31角叉菜胶致肿胀实验足肿胀率本研究中采用角叉菜胶致大鼠足肿胀实验模型，通过分析不同组别大鼠之间足肿胀抑制率的水平，观察足肿胀抑制率的变化趋势，见表1。
从表1中可以看出0 min时各组大鼠足肿胀排水体积无显著性差异，而120 min时观察测定阳性对照组与模型组相比有统计学差异，180 min时观察测定金铃子散高剂量组与模型对照组有统计学差异，从而说明金铃子散高剂量组对角叉菜胶致大鼠足肿胀实验有一定的抑制效果。且180 min抑制效果较120 min显著，呈作用的时间依赖性。
32核磁数据分析结果1HNMR实验数据在核磁谱仪上采集后使用Chenomox软件进行目标性分
析。删除水峰（δ 46～51）。通过自动生成的差异性代谢物含量的相对变化，将实验结果分析得到9个代谢差异物，见图1。
33液质数据分析结果将不同组别的大鼠血清在液质的实验结果，通过XCMS进行样本分析，差异代谢物组筛选与鉴定提取中，将液质联用的正、负离子数据，经标度化预处理数据后，以XCMS建立2种离子模式数据的PCA模型，另外结合系统自动分析出的大鼠血清代谢物中潜在的差异表达代谢物质。从样本正、负离子模式的 LCMS 数据得到9种潜在代谢差异物。利用生物化学数据库（KEGG，METLIN 等）将所得的差异性物质进行解释。同时将得到的差异性代谢物通过在相同液相条件下，对与标准化合物的保留时间和质谱图进行确认，见图2。
正离子模式PCA分析提取前3个主成分方差贡献率（R2）及累计贡献率（Q2）分别为 0913（0894）。说明这种模式下的 PCA 模型有91%以上的变量可用于解释角叉菜胶致大鼠足肿胀模型实验中89%以上的差异，模型预测能力良好。液质数据在XCMS平台进行分析，以t 检验对2组间平均丰度值进行差异统计，以P<005 提取差异变量。剔除加合、同位素及碎片离子，将差异性代谢物在相同色谱条件下建立的标准化合物的液质数据验证化合物的准确性。差异较大的物质结合XCMS分析的结果最終得到9个差异变量。
5组大鼠区分明显，角叉菜胶致足肿胀5组大鼠血清内代谢物呈明显的聚类分布，说明这些不同组别的大鼠之间体内代谢物已显示出明显的差异性，见图3。
34MetPA代谢途径分析通过LCMS和1HNMR筛选出的代谢物共有18个，将这些差异性代谢物的数据导入 MetPA 进行代谢通路查询，得出了相关 23条通路分析的详细结果，综合Raw p，Holm p，FDR（false discovery rate）和 Impact 结果，对与炎症相关代谢通路的重要性进行评价，见表2。
以地图式交互式可视化系统为图形表现形式（代谢组视图，路径视图和复合视图）。代谢组视图见图4。
4讨论
本研究采用了一维核磁技术和液质联用技术的代谢组学方法，通过建立角叉菜胶致炎模型比较金铃子散组与阿司匹林组以及空白组大鼠代谢谱的差异，识别与炎症相关的代谢调节通路，观察金铃子散对角叉菜胶致足肿胀大鼠模型的影响并对炎症相关的通路识别和分析。由代谢网络图可以看出金铃子散对角叉菜胶致大鼠足肿胀模型的影响实验中相关
的代谢通路有柠檬酸循环（TCA循环），丙酮酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢以及乙醛酸和二羧酸代谢。
三羧酸循环和乙醛酸代谢通路产生的柠檬酸盐和琥珀酸盐，在生物氧化呼吸链反应中充当催化剂的角色。三羧酸循环是机体基本物质之间相互联系和转化的枢纽。循环途径中的丙酮酸是机体营养物质代谢的中间产物，可加速脂肪酸氧化分解、降糖和抑制自由基等生理功效[912]，对机体能量代谢有较大影响。同时也是能量代谢的底物，可进一步活化三羧酸循环，增加能量消耗，进而改变机体内乙酰辅酶A的水平，增加脂肪的消耗，影响体内激素和脂肪的代谢[13]。从体内代谢物质的相互关系看出机体内的各种代谢途径是一个有密切联系且相互影响的体系[14]。实验中金铃子散高、中、低剂量组中三羧酸循环的中间体，包括柠檬酸（NMR定量分析，
LCMS负离子m/z 1931）、琥珀酸（NMR定量分析，LCMS负离子m/z 1191）皆呈现随着给药剂量增加含量降低的趋势，然而模型对照组含量较高，说明相对较高含量的柠檬酸加强了ATP的抑制效应，从而使磷酸果糖激酶的活性受到了抑制，导致磷酸烯醇式丙酮酸得到了积累。然而三羧酸循环和氨基酸的合成都需要丙酮酸的参与，丙酮酸的积累使得三羧酸循环中的α酮戊二酸脱氢酶系统活性增强，促进活性氧（ROS）产生，使氧化应激反应增加，从而产生炎症反应，这也是模型组较金铃子散组含量偏高的原因。另外，在LCMS负离子模式下测定的烟酰胺（LCMS负离子m/z 1211）和甲基烟酰胺（LCMS 负离子m/z 1382）随金铃子散剂量的增加水平下降，推测机体炎症使得能量代谢水平降低，其中间代谢物水平也相应降低。另外二羧酸转运蛋白可将柠檬酸、琥珀酸等物质转运到胞内参与能量的合成，是调控能量代谢的一种关键性膜蛋白质[15]。乙醛酸及二羧酸代谢酶还能将羟基丙酮酸还原为D甘油酸或将乙醛酸还原为乙醇酸。金铃子散组中乙醛酸的含量较空白对照组呈现下降趋势，因此二羧酸也可以作为指示机体炎症的生物标记物。
在甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径中，苏氨酸主要通过苏氨酸脱水酶（TDH）和苏氨酸脱氢酶（TDG）以及苏氨酸醛缩酶催化而转变为其他物质，适量苏氨酸可增强机体的免疫性[16]。处于氨基酸代谢中间位置的丝氨酸可在免疫血球素和抗体的产生及为氧化还原势能谷胱甘肽的合成提供 NADPH，通过增加 NADPH 的合成，消除ROS的毒害作用，在维持细胞的存活中起重要作用[16]。甘氨酸可与蛋氨酸和精氨酸合成胍基乙酸，于肝脏甲基化后生成肌酸，并结合高磷酸基团生成磷酸肌酸，当机体消耗能量过多时，磷酸肌酸就可以促进ATP的合成，产生能量。在金铃子散低剂量组中，苏氨酸（LCMS正离子m/z 1181）、丝氨酸（LCMS正离子m/z 1041）和甘氨酸（LCMS负离子m/z 761）含量较空白对照组升高，它们的改变与生物体内能量代谢以及蛋白质脂肪代谢功能异常有关，丝氨酸含量升高推测其可能被用于抵抗机体炎症产生的大量ROS自由基，进而降低炎症反应。另外金铃子散高剂量组丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸含量下降，推测可能是由于金铃子散中川楝子的毒性使机体代谢功能损伤，造成氨基酸代谢调节的不可逆转。
本实验采用1HNMR和LCMS技术的代谢组学研究方法，建立了角叉菜胶致炎模型，通过比较金铃子散组与阿司匹林组以及空白组大鼠代谢谱的差异，识别与炎症相关的代谢物通路，另外结合二甲苯致小鼠耳肿胀模型从药理学角度验证金铃子散对炎症的有效性。在角叉菜胶致大鼠足肿胀实验的分析结果中，金铃子散给药组可以使血清中柠檬酸、琥珀酸含量水平下调，这说明金铃子散可有效干预大鼠体内的糖代谢途径。甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸含量的升高可能是机体自身调节大量活性氧自由基的一种免疫增强反应。另外，在角叉菜胶所致大鼠的炎症模型中，金铃子散高剂量组不能对升高的氨基酸水平进行有效逆转，说明其不能有效阻止炎症部位蛋白质的分解。总的来说，金铃子散在调节机体内炎症方面的机制可能是通过减少氧自由基攻击程度，降低细胞损伤，进而下调机体组织产生炎性细胞因子从而完成机体一系列免疫应答反应，达到抗炎作用。
炎性疾病涵盖了人体多个系统器官，因此加强对相关炎症疾病调节作用机制的研究有更为重要的意义。目前代谢组学采取与计算机高通量分析手段相结合的方式寻找代谢谱的差异，识别与疾病模型相关的代谢物通路，并对可能出现的病证进行代谢通路识别和分析，进而为新的作用靶点药物的研制开发提供新的思路。
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[责任编辑曹阳阳]
[收稿日期]20160715
[基金项目]国家自然科学基金项目（21375147）；国家自然科学基金青年科学基金项目（81501229）；北京自然科学基金项目（7142125）；国家“重大新药创制”科技重大专项（2012ZX09301003001010）
[通信作者]*黄荣清，研究员，主要从事新药质量鉴定和中药代谢组学研究，Email：hrongqing@163com
[作者简介]沈淑洁，硕士研究生，主要从事中药代谢组学研究，Email：guru2016@126com