山东体育学院学报第30卷第6期2014年12月 沙继斌，等不同时程低氧暴露对大鼠髓源性细胞HIF-1α与hGlyrichin表达影响的研究No.6 2014已有研究证明低氧应答的核心元件HIF-1α与机体固有免疫机能存在密切联系，HIF-1α表达上调可激活血液中的髓源性细胞使固有免疫应答增强[1]，并可上调抗菌肽的表达；HIF-1α的增效剂含羞草碱[2]及近期报道的HIF-1α稳定剂AKB-4924[3]自身并无抗菌活性，但可以通过提高胞内HIF-1α表达以增强巨噬细胞与上皮细胞的抗菌活性，有效抑杀具有甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌。hGlyrichin是近年来发现的富含甘氨酸的新型抗菌肽家系的重要人源性成员，其结构及抗菌活性已得到初步确证[4-5]。本研究尝试同步观察不同时程低氧暴露对HIF-1α表达及hGlyrichin表达的影响，为分析二者之间的可能联系提供实验依据。
1材料与方法
1.1实验动物雄性Wistar大鼠60只，体重207±11.4 g，购自军事医学科学院实验动物中心（动物许可证号：SCXK（军）2007-004），随机分为对照组、低氧12、24、36、48、72小时组，分笼常规饲养，自由饮水、进食。采用hypoxico系统模拟海拔2500米常压低氧环境以进行间歇性低氧暴露，每日2小时。累计低氧暴露时间分别为12、24、36、48、72小时后，尾静脉收集静脉血，肝素抗凝，以淋巴细胞分离液分离去除淋巴细胞和单核细胞，然后用右旋糖酐（dextran） 沉降与低渗法去除红细胞，从而得到纯度较高的多形核白细胞，-80℃保存以备指标测定。
1.2主要试剂淋巴细胞分离液（购自Gibco），Trizol（购自Invitrogen），RT-PCR试剂盒（购自Promega），丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、SDS（购自Sigma），HIF-1α抗体（购自Abcam），IPG胶条及buffer（购自Bio-rad），常规试剂均为国产分析纯
1.3引物序列hGlyrichin上游引物： 5’-CGCATGCCGGTGGCCGTGGGT-3’， 下游引物：5’-CCGTTAGCATCGGATGCCCAT-3’；HIF-1α上游引物：5’-CTTTCTTGGAAACGAGTGAAAGG-3’，下游引物：5’-TGAGTAATTCTTCACCCTGCAG-3’；G3PDH上游引物：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’；均由英骏公司合成。
1.4实验方法
1.4.1RNA提取以1‰DEPC水处理所有提取RNA用品，用Trizol裂解液按照《分子克隆指南》RNA提取方法从多形核白细胞中提取RNA，所有离心操作均在4℃冷冻离心机中进行，收集RNA沉淀后在无菌操作台中风干，而后将沉淀溶于20 μl 去离子水，琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取RNA。
1.4.2RT-PCR
1.4.2.1逆转录取所提取RNA10μg与Oligod（T）1 μl混匀后，65℃水浴10 min后迅速置于冰上冷却5 min，按照如下反应体系依次加入下列试剂：RNA酶抑制剂3 ul，AMV RT5×Reactiong Buffer1 ul，100mM DTT1ul，10mM dNTP 4ul，AMV反转录酶1ul，1‰ DEPC 水加至总体积为20 ul，混匀后置于42℃恒温箱中反应1 h，取逆转录产物cDNA 2 μl作为PCR模板，同时以G3PDH作为内参。
1.4.2.2PCR逆转录所得cDNA2ul，hGlyrichin/HIF-1α上游引物0.5 ul，hGlyrichin/HIF-1α下游引物0.5 ul，G3PDH上游引物0.5 ul，G3PDH下游引物0.5 ul，2.5 μM dNTP4 ul，10×PCR缓冲液2 ul，rTaq酶0.5 ul，ddH2O加至总体积为20 ul；95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，56℃退火30 sec，72 ℃延伸1 min，共32个循环，72 ℃延伸7 min，琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR结果。
1.4.3Western BlotSDS-PAGE结束后取下凝胶，在电转仪中与预处理过PVDF膜按次序叠放好，采用半干法转膜，电压12 V，转膜30 min；将电转后的膜在2.5%脱脂牛奶中室温封闭2 h；TBS冲洗3次，5 min/次；用TBS按1：3000稀释兔源HIF-1α一抗，与PVDF膜作用2 h；TBST冲洗3遍，每次15 min；用TBS按1：5000稀释HRP标记羊抗兔二抗，与PVDF膜作用2 h；TBST冲洗3遍，每次15 min；将A液、B液等体积混合，将混合物覆盖在膜表面1～2 min，在暗室中将X光片覆盖在膜的上面放入暗盒中，曝光1 min后显影、定影，定影后用去离子水冲洗，以β-actin作为内参蛋白，观察结果。
1.4.4双向电泳取对照组与低氧72小时组收集所得髓源性细胞制备蛋白样品后参照Gorg教授实验室方法进行双向电泳，胶条室温下平衡10分钟后，被动式泡胀，而后进行第一向等电聚焦（IEF）IEF结束后将胶条平衡两次，采用12.5%的SDS胶进行第二向，电泳结束后取下凝胶用双蒸水漂洗三次，参照EMBL的考马斯亮蓝染色方法进行染色加以优化，染色中止后用ImageScanner II 扫描仪扫描，然后用Image Master 2D Planium进行分析。将其中差异较大的四个样品送质谱检测，常规检索条件设置：其中Mass values选择 Monoisotopic ，Peptide Mass Tolerance设定为 ± 0.3 Da，Peptide Charge State设定为 1+ ，Max Missed Cleavages设定为1 ，Number of queries值设定为25。
2实验结果
2.1不同时程间歇性低氧暴露后多形核白细胞HIF-1α及hGlyrichin RT-PCR结果
2.1.1间歇性低氧后多形核白细胞RNA提取
如图1所示，从大鼠多形核白细胞中所提取到的RNA 18s与28s两条带清晰、完整，紫外分光光度计检测OD260/ OD280比值在1.8-2.0之间，表明所提取的RNA质量较好，适合用于下一步的RT-PCR。
图1间歇性低氧暴露后多形核白细胞RNA电泳结果
1、2、3、4、5：间歇性低氧暴露12 h、24 h、36 h、48 h、72 h组多形核白细胞RNA；M：DL20002.1.2不同时程间歇性低氧暴露后多形核白细胞HIF-1α及hGlyrichin的mRNA表达变化
如图2所示，间歇性低氧暴露12 h后未见有HIF-1α条带，在间歇性低氧暴露24 h后其表达量依然很低，未见明显条带，间歇性低氧暴露36 h后开始出现较明显条带，继而在间歇性低氧暴露48 h组、间歇性低氧暴露72 h组中HIF-1α表达量持续显著增加；与之相比，在不同时程间歇性低氧暴露后，hGlyrichin表达量未见有显著改变。以上结果提示HIF-1α作为机体低氧应答的核心元件，对低氧刺激较为敏感，但较短时间低氧暴露并未使HIF-1α表达显著上升，在低氧处理36 h后其表达量明显升高且随时程延长而持续增加。hGlyrichin作为一种在不同组织中广泛分布的抗菌肽，可能由于本地表达水平较高，间歇性低氧暴露后其表达量并未受到低氧刺激的显著影响。
图2对照组与不同时程间歇性低氧暴露组
RT-PCR电泳结果
1.对照组； 2. 间歇性低氧暴露12 h组； 3. 间歇性低氧暴露24 h组；4. 间歇性低氧暴露36 h组；5. 间歇性低氧暴露48 h组；6. 间歇性低氧暴露72 h组，下同。2.2不同时程间歇性低氧暴露后多形核白细胞HIF-1α蛋白表达变化
如图3所示，与内参β-actin相比，HIF-1α蛋白表达量随间歇性低氧暴露时程的而持续增加，其变化趋势与RT-PCR结果基本一致。稍有不同的是，与RT-PCR结果相比，在间歇性低氧暴露24 h后蛋白印渍检测已可见到较为显著条带。由于内参β-actin条带灰度差异较大，故未进行定量分析比较。
图3对照组与不同时程间歇性低氧暴露组
Western Blot结果2.3不同时程间歇性低氧暴露后多形核白细胞蛋白质差异表达结果
蛋白样品定量：以1 mg/ml的BSA溶液作为标准。分别取0、2.5、5、7.5、10、15、20、25 μl标准BSA溶液于1.5 ml离心管中，加双蒸水稀释至100 μl，再加入1 ml工作液，混合均匀，60 min之内测出每管混合液在595 nm处的吸光度。以蛋白浓度为横坐标，A595nm为纵坐标做工作曲线，如图2～图4。样品的测定方法同上。分别取1、2、3、5、7.5、10 μl待测蛋白于1.5 ml离心管中，加入双蒸水稀释至100 μl，将蛋白样品稀释至合适浓度，按上述操作程序测定595 nm处的吸光度，按工作曲线测定样品浓度，而后上样。
双向电泳胶图显示与对照组相比， 间歇性低氧暴露72 h后蛋白表达总体似呈下降趋势（图4a），经软件比对后选取其中四个表达量差异较为显著的点（图4b）进行质谱鉴定，其中A、B、C三点表达量显著增加，D点表达量显著下降，质谱鉴定结果B点蛋白质为tropomyosin 4 ，低氧后其表达量显著增高，其余未检索出结果。
图4对照组与间歇性低氧暴露
72 h组蛋白质差异表达结果
a .双向电泳结果比较；b.有显著表达差异蛋白点比较
3分析讨论
对低氧生理应答的认识相继经历了由经典低氧效应到促红细胞生成素（EPO），由EPO 到低氧诱导因子1（HIF-1），由HIF-1到氧感受器如脯氨酰羟化酶、天冬酰胺酰羟化酶的过程[1，6]，其中HIF-1在细胞低氧应答反应体系中居于核心地位。一般认为，低氧条件下，机体氧感受器感受到低氧信号刺激后，通过低氧信号转导通路引起一系列应激性变化从而产生低氧适应，HIF-1在介导低氧应答过程中起着重要作用。
3.1不同时程间歇性低氧暴露后多形核白细胞HIF-1α表达变化
HIF-1是由α和β两个亚基组成异二聚体蛋白，HIF-1β为HIF-1的组成性表达亚基，而HIF-1α则为HIF-l的氧调节亚基。HIF-1α通常在稳定后移位入核，与配体芳香烃受体核转位因子结合，而后通过与低氧应答元件的5’端增强子序列结合而后激活其它特定的基因，可有效调节细胞、组织、器官不同水平的缺氧应答反应以维持氧稳态。[1]
已有研究证实HIF-1α在大鼠的一些器官中（脑、心、肾、肝、肺、骨骼肌）普遍表达，且在脑、肺、骨骼肌、肾可被低氧显著诱导。低氧习服是机体在外界胁迫条件下，为了维持自身的稳定，减轻低氧对机体的损伤而采取的自身防御措施。低氧训练应激对机体的刺激受不同氧浓度（模拟海拔高度）、低氧刺激时间、刺激方式条件影响，结果可能存在差异，但大多数研究结果支持在低氧应激后HIF-1α表达上调。[6]
王雪冰等研究发现[7]，相当于海拔3 500 m低氧训练4周后大鼠肾皮质HIF-1α、VEGF mRNA水平均呈显著上调，且HIF-1α与VEGF表达呈高度正相关。赵鹏等的研究结果也证实低氧和训练能增加人体和动物骨骼肌 VEGF mRNA 水平[8]。汪晓筠等的研究发现与对照组比较，高原组大鼠血清中HIF-1α含量明显增高，血浆中ROS含量明显降低[9]。以上研究结果与我们的结果很相近，我们发现在间歇性低氧暴露时程累加到36小时后，HIF-1α mRNA水平开始出现显著升高，之后随时程延长其水平依然升高且具有显著性。HIF-1α表达上调除可影响VEGF外，对其他下游因子同样有较强调节效应，如黄丽英等的研究结果表明低氧运动后血清EPO水平显著上升，肾脏EPO mRNA水平显著升高[10]，低氧后HIF-1α表达增加是促进EPO产生分泌的主要因子。
低氧应激除可调节HIF-1α转录之外，还可以有效调节HIF-1α蛋白表达。瞿树林课题组利用免疫组织化学染色观察到模拟高海拔低氧环境及力竭性运动均可促进心、肝、肾HIF-1a 蛋白表达[11]，在低氧应激后心、肝、肾均可见到多量HIF-1α免疫阳性物质，主要集中于胞浆中，少量可见在胞核中表达。刘铭等将大鼠置于模拟海拔4000m高度的低氧仓中，持续低氧刺激4周后用免疫组化法检测大鼠骨骼肌组织HIF-1α蛋白表达，结果发现HIF-1α在低氧应激后表达上调[12]，其表达水平随着低氧刺激的时间延长而增高。我们采用蛋白印渍检测了不同时程间歇性低氧暴露后HIF-1α的蛋白表达变化，结果发现在间歇性低氧暴露时间累加至24小时后有较明显表达增加，之后表达水平随间歇性低氧暴露时程延长呈上升趋势，由于对照β-actin检测表达水平不够稳定，未进行定量分析。该结果与上述研究者结果相类似，但与所检测到的HIF-1α mRNA水平在间歇性低氧暴露累计到36小时后才开始有显著升高的变化趋势并不一致。用双向电泳结合质谱分析蛋白质差异表达时只鉴定出tropomyosin 4一种蛋白质，作为原肌球蛋白家族的一员，目前尚未有其与低氧密切相关的研究报道。
3.2不同时程间歇性低氧暴露后多形核白细胞抗菌肽hGlyrichin表达变化
固有免疫是机体抵御外来的细菌、病毒及其他有害病原体的古老应激反应，是维系组织稳态及正常生命的必备先决条件，已有研究证实低氧与机体免疫力密切相关。人体中不同部位与区域氧分压差别极大，肺泡毛细血管氧分压约为100 mmHg，而淋巴器官氧分压则可能降至约4 mmHg，上述不同部位及区域微环境的巨大差异使得固有免疫相关髓源性细胞产生相应的代谢性适应，氧分压改变成为调节髓源性细胞机能的重要信号。
固有免疫系统的髓源性细胞在正常情况下都处于静息状态，而活性氧诱发的细胞结构完整性损伤可导致髓源性细胞的激活，进而引发炎症反应，炎症反应可能是低氧与固有免疫的交叉点之一。固有免疫系统中的多型核白细胞可通过氧依赖性以及非氧依赖性的两方面抗菌系统来发现、识别、吞噬、最终消灭入侵的病原微生物， PMN细胞数目的减少意味着机体免疫机能抑制或者说被感染的危险性增加。
HIF-1α在与病原微生物接触后随即被激活而后调节吞噬细胞的固有免疫机能[13-14]，抗菌肽（antimicrobial peptides， AMPs）是固有免疫系统的重要成分之一，具有直接抑杀病原微生物与针对宿主进行免疫调节的双重作用。在HIF-1被选择性敲除的角质细胞当中，cathelicidin的分泌显著减少，而坏死区域皮肤金黄色葡萄球菌的数量增加，反之，如果与HIF-1结合的肿瘤抑制蛋白VHL缺失的话，cathelicidin的分泌增加，金黄色葡萄球菌的感染率下降[15]，以上结果提示HIF-1对于抗菌肽的产生有直接调节作用[13-15]。我们的研究结果发现在间歇性低氧暴露后随时程延长hGlyrichin表达水平有上升趋势，但在不同时程时间点之间未观察到显著性差异。这可能与hGlyrichin本身是一种广布于机体各组织的富含甘氨酸的天然抗菌肽，其在血液中本底表达水平较高有关。我们的实验结果未能验证不同时程间歇性低氧暴露后机体HIF-1α表达水平上调可促进hGlyrichin的表达的假设。
参考文献：
[1]沙继斌.HIF-1——低氧与固有免疫的联系者[J].生物学杂志，2013，30（3）：77-80.
[2]杨超文，尹丽莉，张咏，等.人源新基因hGlyrichin的克隆及其功能的初步研究[J].军事医学科学院院刊，2005，29（6）：501-505.
[3]Jibin Sha，Guang Zhao，Xiaojuan Chen，et al.Antibacterial potential of hGlyrichin encoded by a human gene [J].Journal of Peptide Science，2012， 18（2）：97-104.
[4]Annelies S.Zinkernagel， Carole Peyssonnaux， Randall.S.Johnson.Pharmacologic augmentation of hypoxia-inducible factor-11 with mimosine boosts the bactericidal capacity of phagocytes [J]. The Journal of Infectious Diseases， 2008，197：214-217.
[5]Cheryl Y. M. Okumura， Andrew Hollands，Dan N. Tran，et al.A new pharmacological agent （AKB-4924） stabilizes hypoxia inducible factor-1 （HIF-1） and increases skin innate defenses against bacterial infection [J]. J Mol Med，2012，90（9）：1079-1089.
[6]邓树勋，王健，主编.高级运动生理学-理论与应用[M].北京：高等教育出版社，2006：126.
[7]王雪冰，路瑛丽，冯连世，等.低氧训练对大鼠肾皮质HIF-1α、VEGF基因表达的影响[J].体育科学，2009，29（2）：59-64.
[8]赵鹏，路瑛丽，冯连世，等. 低氧训练对大鼠骨骼肌VEGF mRNA表达及毛细血管密度的影响[J].中国运动医学杂志，2009，28（2）：131-135.
[9]汪晓筠，马祁生，景玉宏，等. 高原低氧对大鼠血清中低氧诱导因子-1α含量和血浆中活性氧含量及肝细胞超微结构的影响[J]. 环境与健康杂志，2012，29（10）：884-886.
[10]黄丽英，林文弢，翁锡全，等.低氧运动对大鼠促红细胞生成素的影响[J].广州体育学院学报，2006，26（1）：44-47.
[11]林喜秀，瞿树林，周桔，等. 低氧训练对大鼠心、肝、肾、海马组织细胞凋亡的影响及其机制研究[J].中国运动医学杂志，2012，31（2）：146-156.
[12]刘铭，瞿树林，刘文峰.不同持续时间低氧后运动对大鼠骨骼肌组织HIF-1α 蛋白表达的影响[J].湖南师范大学学报：医学版，2012，9（4）：10-13.
[13]Jordi Rius，Monica Guma，Christian Schachtrup，et al.NF-κB links innate immunity to the hypoxic response through transcriptional regulation of HIF-1a [J]. Nature，2008，453：807-812.
[14]Carole Peyssonnaux， Datta V， Cramer T.HIF-1expression regulates the bactericidal capacity of phagocytes [J]. J Clin Invest， 2005，115：1806 -1815.
[15]Carole Peyssonnaux， Adam.T.Boutin，Annelies S.Zinkernagel.Critical Role of HIF-1a in keratinocyte defense against bacterial infection [J]. Journal of Investigative Dermatology， 2008，128：1964-1971.第30卷第6期2014年12月山东体育学院学报Journal of Shandong Institute of Physical Education and SportsVol.30 No.6December 2014
振动训练对大鼠跟腱生物力学性能影响的实验研究
The Experimental Research of Vibration Training on Biomechanical Properties of Rat Achilles’ Tendon