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[摘要] 目的 考察间歇吸氧对小鼠肺、脑组织中抗氧化蛋白Peroxiredoxin 6（Prx 6）含量的影响，探讨间歇吸氧对抗氧中毒的机制。 方法 将小鼠随机分为正常组、持续暴露后即刻组、间歇暴露后即刻组、持续暴露后24 h组和间歇暴露后24 h组，通过不同暴露方法，分别取小鼠肺、脑组织采用免疫组织化学和Wester blot等方法测定Prx 6的含量。 结果 经高压氧暴露的各组小鼠肺组织中Prx 6的含量均明显高于正常组（P < 0.05或P < 0.01），持续暴露后即刻组与间歇暴露后即刻组差异无统计学意义（P > 0.05），间歇暴露后24 h组含量明显高于持续暴露后24 h组（P < 0.01），并且高于各自对应的暴露后即刻检查的结果（P < 0.01）。经高压氧暴露的各组小鼠脑组织中Prx 6的含量均明显低于正常组（P < 0.01），持续暴露后即刻组与间歇暴露后即刻组差异无统计学意义（P > 0.05），间歇暴露后24 h组与持续暴露后24 h组高于各自对应的暴露后即刻检查的结果（P < 0.05），且间歇暴露后24 h组含量接近正常组（P > 0.05）。 结论 间歇吸氧可以促进肺、脑组织中Prx 6的含量增加，从而增强组织的抗氧化能力。
[关键词] Peroxiredoxin 6；高压氧；间歇吸氧；氧中毒
[中图分类号] R459.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）02（c）-0018-04
Effects of intermittent hyperbaric oxygen exposure on the contents of peroxiredoxin 6 in the lung and brain of mice
XU Chun1 LI Runping2▲
1.Department of Outpatient， the 61565 Troops of People"s Liberation Army， Beijing 102699， China； 2.Department of Diving Medicine， Faculty of Naval Medicine， the Second Military Medical University， Shanghai 200433， China
[Abstract] Objective To investigate the effects of intermittent hyperbaric oxygen exposure on the contents of peroxiredoxin 6 （Prx 6） in the lung and brain of mice， and to explore the mechanism underlying intermittent hyperbaric oxygen exposure protecting against oxygen toxicity. Methods Mice were randomly divided into normal group， immediate group after continuous exposure， immediate group after intermittent exposure， live 24 h group after continuous exposure， live 24 h group after intermittent exposure. The content of Prx 6 in the lung and brain were detected using immunohistochemistry and western blot analysis respectively. Results In lung， compared with normal group， Prx 6 contents of all mice experiencing hyperbaric oxygen exposure were increased （P < 0.05 or P < 0.01）. There was no significant difference between immediate group after continuous exposure and immediate group after intermittent exposure （P > 0.05）. The Prx 6 content of live 24 h group after intermittent exposure was significantly higher than that of live 24 h group after continuous exposure （P < 0.01）， and the result in each live 24 h group was also higher than that in each immediate group （P < 0.01）. In brain， compared with normal group， Prx 6 contents of all mice experiencing hyperbaric oxygen exposure were decreased （P < 0.01）. There was no significant difference between immediate group after continuous exposure and immediate group after intermittent exposure （P > 0.05）. The Prx 6 contents in each live 24 h group was higher than that in each immediate group （P < 0.05）， and the content of live 24 h group after intermittent exposure was close to the normal group （P > 0.05）. Conclusion Intermittent hyperbaric oxygen exposure can facilitate the expression of Prx 6 in lung and brain， and this may be related to the enhanced ability to protect against oxygen toxicity.
[Key words] Peroxiredoxin 6； Hyperbaric oxygen； Intermittent hyperbaric oxygen exposure； Oxygen toxicity
近年来发现过氧化物酶家族成员中的抗氧化蛋白（peroxiredoxin，Prxs）在体内广泛分布，现已知在哺乳动物中至少存在6种Prx亚型（Prx Ⅰ～Ⅵ）。它们利用包含巯基的蛋白，将过氧化物还原，起到降解毒性的作用[1-5]。高压氧暴露时，体内各种产生氧自由基的环节被激活，生成大量的活性氧（ROS），这些活性氧一方面可以氧化体内各种物质而导致组织损伤，另一方面也可以启动和参与细胞内多种物质代谢和信号转导过程，具有强大的病理生理学功能[6-10]。间歇吸氧很可能通过激活Prxs，进而降解活性氧，实现其对抗氧中毒发生的作用。故本研究将探讨间歇高压氧暴露对小鼠肺、脑组织中抗氧化蛋白（Prx 6）含量的影响，以期为阐明间歇吸氧预防氧中毒的作用机制提供部分科学依据。
1 材料与方法
1.1 仪器与气体
动物实验用高压舱，设计工作压力为2.5 MPa。医用纯氧，氮氧混合气购于上海市江南气体公司。
1.2 动物及分组
购入10月龄雄性C57BL/6小鼠共50只，体重20～22 g，合格证号：医动字第14-2-6号。饲予正常饲料，自由饮水和12 h照明循环，适应2周后进行实验，随机分为5组，包括正常组（未经高压氧暴露）、持续暴露后即刻组（持续暴露法结束即刻取材）、间歇暴露后即刻组（间歇暴露法结束即刻取材）、持续暴露后24 h组（持续暴露法结束继续存活24 h后取材）和间歇暴露后24 h组（间歇暴露法结束继续存活24 h后取材），每组10只并作相应标记。
1.3 高压氧暴露方法
①持续暴露法：将持续暴露后即刻组和持续暴露后24 h组小鼠匀速加压至280 kPa，持续暴露至6 h后停止高压氧暴露，将舱内压力匀速减至常压出舱。②间歇暴露法：将间歇暴露后即刻组和间歇暴露后24 h组小鼠在暴露过程中，交替呼吸60 min的O2和30 min的氮氧混合气（氧浓度为20%），至6个循环后停止暴露减压出舱。
1.4 免疫组织化学法检测Prx 6在肺和脑组织中的表达
小鼠经生理盐水和多聚甲醛灌注后，取肺和脑组织，常规石蜡包埋，制片。免疫组化采用SP法，切片常规脱蜡至水，微波抗原修复，3% H2O2孵育，以消除内源性过氧化物酶，正常兔血清封闭，一抗为兔抗鼠多克隆抗体（购自abcam公司），1∶500稀释，4℃孵育过夜，再以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（购自Sant Cruz公司），37℃孵育60 min，用DAB显色，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作阴性对照。免疫组化结果扫描输入电脑后每组随机选择20个细胞用图像分析系统对各组灰度值进行测定。
1.5 Western blot分析Prx 6在肺和脑组织中的表达
采用颈椎脱臼法处死，快速取小鼠肺和脑组织，经漂洗吸干水分后置入4℃组织蛋白裂解缓冲液（购自凯基生物公司）中匀浆，9500 r/min离心20～30 min，离心半径12 cm，吸取上清，测定蛋白浓度，用十二烷基硫酸钠，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白至PVDF膜（购自AMERSCO公司），用含脱脂奶粉的TBST缓冲液包被PVDF膜2 h后，浸入含脱脂奶粉的TBST稀释兔抗鼠多克隆抗体（购自abcam公司）1∶500稀释，4℃孵育过夜，TBST漂洗后转入含脱脂奶粉的TBST稀释的二抗（购自Sant Cruz公司）中2 h，TBST充分漂洗后，ECL发光法（购自Pierce Biotechnology公司）检测Prx 6蛋白表达水平。内参照用小鼠源单克隆抗体β-actin（购自Sigma公司），二抗为羊抗小鼠IgG（购自康成生物公司），均为1∶2000稀释。结果扫描入电脑后用图像分析系统分别测定各组Prx 6蛋白和β-actin的积分灰度值，用各组Prx 6蛋白积分灰度值除以相应的β-actin积分灰度值获得相对积分灰度值，做图时以正常组为1，其余各组以其与正常组相对比值计算。
1.6 统计学方法
用SPSS 11.5统计软件对结果进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组之间的比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 高压氧暴露对小鼠肺组织中Prx 6含量的影响
免疫组化结果显示，Prx 6在肺组织中主要分布于肺泡上皮细胞、细支气管上皮细胞以及血管上皮细胞中。免疫组化结果与Western blot检测结果均示：经高压氧暴露的各组小鼠肺组织中Prx 6的含量均明显高于正常组（P < 0.05或P < 0.01），持续暴露后即刻组与间歇暴露后即刻组差异无统计学意义（P > 0.05），间歇暴露后24 h组含量明显高于持续暴露后24 h组（P < 0.01），并且高于各自对应的暴露后即刻检查的结果（P < 0.01）。见图1～3。
A：正常组；B：持续暴露后即刻组；C：间歇暴露后即刻组；D：持续暴露后24 h组；E：间歇暴露后24 h组
图1 小鼠肺组织中Prx 6的免疫组化检测结果（200×）
A：正常组；B：持续暴露后即刻组；C：间歇暴露后即刻组；D：持续暴露后24 h组；E：间歇暴露后24 h组
图2 小鼠肺组织中Prx 6的Western blot检测结果
与正常组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与持续暴露后24 h组比较，▲▲P < 0.01
图3 小鼠肺组织中Prx 6的Western blot检测结果统计分析（n = 4）
2.2 高压氧暴露对小鼠脑组织中Prx 6含量的影响
免疫组化结果显示，Prx 6在脑组织中主要分布于星形胶质细胞与少突等胶质细胞中。免疫组化结果与Western blot检测结果均显示：经高压氧暴露的各组小鼠脑组织中Prx 6的含量均明显低于正常组（P < 0.01），持续暴露后即刻组与间歇暴露后即刻组差异无统计学意义（P > 0.05），间歇暴露后24 h组高于持续暴露后24 h组（P < 0.05），并且高于各自对应的暴露后即刻检查的结果（P < 0.05），且间歇暴露后24 h组含量接近正常组（P > 0.05）。见图4～6。
A：正常组；B：持续暴露后即刻组；C：间歇暴露后即刻组；D：持续暴露后24 h组；E：间歇暴露后24 h组
图4 小鼠脑组织中Prx 6的免疫组化检测结果（100×）
A：正常组；B：持续暴露后即刻组；C：间歇暴露后即刻组；D：持续暴露后24 h组；E：间歇暴露后24 h组
图5 小鼠脑组织中Prx 6的Western blot检测结果
与正常组比较，**P < 0.01；与持续暴露后24 h组比较，▲P < 0.05
图6 小鼠脑组织中Prx 6的Western blot检测结果统计分析（n = 4）
3 讨论
大量实践经验证明，采用间歇性短时间吸入氧分压相对较低的混合气或压力相等的压缩空气，可以有效延缓长时间连续吸高压氧过程中发生氧中毒的时间。但目前国内外对其机制的研究甚少[11-12]。Frank等[13]发现，将大鼠暴露于96～101 kPa（0.95～1.0 ata）的氧气中48 h，然后给予24 h的空气“休息期”，它们可以耐受以后3～7 d的高氧暴露，仅有轻度肺水肿，无死亡。氧耐力提高的诱导作用与“休息期”后再次暴露于高压氧时肺内的抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶以及谷胱甘肽过氧化物酶活力的显著增加相关。即使将吸空气的“休息期”时间缩短到6 h，所有大鼠在再次暴露于高压氧时都能存活。Harabin等[14]研究指出间歇暴露组的实验鼠惊厥潜伏期和生存时间均明显高于持续暴露组。这些都提示间歇暴露可能与提高氧耐力的机制有关，在能够引起相当毒性的高压氧暴露之后，给予适当的空气恢复期，能在随后的高压氧暴露中诱导抗氧化酶的产生，从而对抗氧中毒。
研究表明，Prx 6是具有非硒依赖性谷胱甘肽过氧化物酶和非钙离子依赖性磷脂酶A双重功能的蛋白[15-19]。它可以利用还原因子谷胱甘肽还原有机或无机的氧化物如过氧脂质和H2O2等。本研究结果显示，长时间高压氧暴露可刺激机体肺组织中Prx 6含量明显升高，并且暴露结束小鼠继续存活24 h后，含量升高得更加明显，这是机体对高压氧暴露引起的氧化性肺损伤的一种保护作用。在脑组织中，高压氧暴露可以导致Prx 6含量明显降低，笔者分析这可能与Prx 6在肺组织表达比脑组织高，研究发现Prx 6在肺泡Ⅱ型上皮细胞和细支气管的Clara细胞中存在高度表达[20-21]，也可能与不同的间歇暴露方案或者暴露模式导致抗氧化酶活性发生不同改变有关。但暴露结束24 h后，Prx 6含量较暴露结束后即刻显著升高，同样表明机体存在一个大量产生Prx 6来对抗和修复氧化性损伤的过程。这些结果表明Prx 6对高压氧导致的氧化损伤反应较为敏感，是一个较为快速产生的抗氧化分子。研究结果同时显示，高压氧暴露结束24 h后，间歇暴露组肺、脑组织中Prx 6的含量更高，表明间歇吸氧可以更加有力地促进机体产生Prx 6来对抗氧化损伤，这可能与其能够有效延缓氧中毒发生有较为密切的联系。
与已有的间歇吸氧引起机体内各种与氧化还原有关的酶活性或含量变化存在升高与降低等不一致情况不同[14]，笔者的初步研究显示，间歇吸氧可以刺激机体内与氧中毒密切相关的肺、脑组织中Prx 6的含量显著升高，这一结果为从间歇吸氧提高机体抗氧化能力的角度阐明其作用机制找出了一个新的联结点，也为进一步寻找能够有效对抗氧中毒的措施提供了新的关注点，这对于深入阐明间歇吸氧对抗氧中毒的机制具有重要意义。
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（收稿日期：2015-11-10 本文编辑：张瑜杰）