摘要：目的：探讨ATP结合盒转运子A1（ATP-Binding Cassette Transporter 1，ABCA1）基因R219K多态性与广西汉族心血管疾病的关系。方法：采用PCR-RFLP技术，对无血缘关系的心血管疾病人群113例和非心血管疾病人群61例的ABCA1基因R219K位点G→A（Arg219Lys）进行检测，分析其基因多态性。结果：在心血管疾病组中，除HDL比非心血管疾病组低外，其余血脂指标均高，其中TC、LDL与ApoB在两组间的差异有统计学意义(P<0.05)。广西汉族心血管疾病人群的RK型频率最高，RR型次之，KK型频率最低；心血管疾病组的KK基因型频率（0.129）低于非心血管疾病组(0.148)，但差异无统计学意义(P>0．05)。RR、RK和KK三种基因型的血脂水平差异没有统计学意义(P>0．05)，女性心血管疾病人群KK型的HDL比RR型的高(P>0.05)，而KK型的TG和VLDL比RR型低(P<0.05)。结论：ABCA1基因R219K变异对心血管疾病可能具有保护作用，但具体保护机制及ABCA1基因R219K在心血管疾病人群中基因型分布频率也有待于更大样本的观察和进一步深入研究。
关键词：ABCA1基因；单核苷酸多态性（SNP）；心血管疾病
中图分类号： R541 文献标识码： A 文章编号： 1008-2409(2007)06-1169-04
Relationship between the R219K Polymorphism of ATP-Binding Cassette Transporter 1 Gene and cardiovascular disease/HUANG Jian, HUANG Wen-Xin, XIA Zhong-Hua,et al.∥Department of Biochemistry,Guilin Medical College,Guilin 541004, China
Abstract:Objective:To investigate the relationship between the R219K polymorphism of ATP-Binding Cassette Transporter 1 gene and cardiovascular disease in Han population of Guangxi. Methods:PCR-RFLP was used to examine ABCA1 gene R219K polymorphism G→A(Arg219Lys) of 113 non-blood-related patients with cardiovascular disease and 61 without cardiovascular disease. Results:The findings showed that except that the HDL level in the cardiovascular disease group was lower than that in the control group, and the other blood lipid levels in the former group were higher than those in the latter group, among which the differences in TC, LDL, and ApoB between the two groups were statistically significant (P<0.05). The highest frequency of ABCA1 R219K genetic variation was RK genotype,the next was RR genotype and the lowest was KK genotype in Han population with cardiovascular disease of Guangxi Province. The KK genotype frequency in the cardiovascular disease group(0.129) was lower than that in the control group(0.148) (P>0.05).No significant difference was found in blood lipid level among RR,RK and KK genotype(P>0.05).The KK genotype had an insignificantly higher HDL level (P>0.05) and a lower TG and VLDL level (P<0.05) than RR genotype in women patients with cardiovascular disease. Conclusion:ABCA1 R219K polymorphism may have a protective function against cardiovascular disease. More research work should be done to confirm the mechanism and the genotype frequency in cardiovascular disease group in the future.
Key words:ABCA1 gene; Single Nucleotide Polymorphism（SNP）；cardiovascular disease
三磷酸腺苷(ATP)结合盒转运子A1(ATP-binding cassette transporter1,ABCA1)属于一组利用ATP作为能量来运输不同物质到细胞内外或不同的细胞器上高度保守的跨膜蛋白质，存在于不同的组织。ABCA1是ABC超家族的成员之一，研究发现，ABCA1介导细胞内胆固醇和磷脂外流到细胞表面，是高密度脂蛋白（HDL）介导胆固醇逆向转运的第一步，部分位于ABCA1基因编码区和基因调控序列的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）与血脂水平、冠状动脉狭窄程度和冠心病事件相关[1-3]。R219K是ABCA1基因编码区常见的变异，研究认为，ABCA1基因R219K对心血管系统的保护作用与其调节脂代谢的直接作用有关，这类研究多集中于正常人群与心血管疾病人群[3-5]，笔者采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对广西汉族人群中R219K基因多态性进行检测，以分析ABCA1基因R219K多态性与血脂及心血管疾病的关系，结果报告如下。
1 对象和方法
1.1 研究对象
研究对象为无血缘关系的桂林医学院附属医院心血管疾病人群113例，其中男性60例，女性53例，年龄(64.57±13．34)岁，体重指数23.74±3.73；非心血管疾病人群61例，其中男性14例，女性47例，年龄(57.34±14.62)岁。体重指数22．19±4.88；两组均排除严重肝、肾、肿瘤等疾病。两组间年龄比较有显著性差异（P<0.05），其中心血管疾病人群的平均年龄大于非心血管疾病人群；两组间体重指数和性别无显著性差异。
1.2 生化指标检测
研究对象均采用禁食12h后，于清晨空腹采血，测定血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、极低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、载脂蛋白A（ApoA）、载脂蛋白B（ApoB）、空腹血糖以及血红蛋白、白细胞、血小板计数、肝、肾功能等生化指标，由检验科专人质控检验 。各指标均采用盲法测定。
1.3 基因组DNA提取及基因型分析
1.3.1 基因组DNA提取 全血用EDTA抗凝，使用标准的酚-氯仿提取法提取白细胞DNA，溶于TE，4℃贮存备用。
1.3.2 PCR扩增 PCR反应体系为25μl，含有基因组DNA 0.1~0.3μg，上游和下游引物分别为10pmol，dNTP mix 0．25mmol，Taq 酶0.5U，10×缓冲液2.5μl，MgCl2 20mmol及灭菌去离子水适量，应用自动循环仪进行扩增。扩增条件：预变性94℃ 4min，反应循环：变性94℃ 50s、退火58℃ 50s、延伸72℃ 1min，循环32次；最后72℃延伸10min。扩增产物经2 %琼脂糖凝胶电泳检测。引物设计参考有关文献[3]，由上海生工生物
1.3.3基因型分析上述PCR产物以限制性核酸内切酶Xag I(MBI,Fermentas) 37℃ 酶切2~3h。反应液终体积20μL，PCR反应产物10μL，Xag I内切酶10U。酶切产物在2%琼脂糖凝胶中电泳,溴乙啶染色，在UVP凝胶成像系统下观察电泳结果并确定基因型。R219K多态性位点的PCR扩增产物长177 bp，经Xag I酶切后，K等位基因被切为107bp和70bp两个片段，而R等位基因由于无酶切位点仍为一个177 bp的片段（图1）。这样存在3 种可能的基因型：纯合子RR(177bp) 、杂合子RK(177bp，107bp和70bp)、纯合子KK(107bp和70bp)。
1和6为RK杂合子，2和4为KK纯合子，3和5为RR纯合子，M为50bp ladder分子量标准
1.4 统计学处理
计算各组基因型及等位基因频率，采用χ2检验，确认符合Hardy-Weinberg遗传平衡，组间分类资料的比较采用χ2 检验，组间定量资料比较用t检验或ANOVA检验。数据用SPSS12．0软件分析，以P<0.05 为差异有显著性。
2 结果
2.1 生化指标
心血管疾病组的血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、极低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）、载脂蛋白A（ApoA）及载脂蛋白B(ApoB)明显高于非心血管疾病组，其中TC、LDL与ApoB在两组间的差异有统计学意义(P<0.05)；心血管疾病组的高密度脂蛋白（HDL）低于非心血管疾病组，但差异无统计学意义(P>0.05)，如表1所示。
对心血管疾病组和非心血管疾病组的基因型分布进行了平衡检验，心血管疾病组:χ2 =0.127，df=1，P>0.05；非心血管疾病组:χ2=0.516，df=1，P>0.05，两组基因型都符合Hardy-Weinberg 遗传平衡，所以，本研究所选择的研究人群基因频率能够代表群体的基因分布。其中广西汉族心血管疾病人群的RK型频率最高，RR型次之，KK型频率最低；心血管疾病组的R等位基因频率为0.634，K等位基因频率为0.366；非心血管疾病组的R等位基因频率为0.656，K等位基因频率为0.344。非心血管疾病组的KK基因型频率(0.148)高于心血管疾病组（0.129），但两组基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义(P>0.05)。
2.3 ABCA1基因型影响血脂的性别差异
对心血管疾病组的基因型与血脂的关系进行了统计，如表2所示，男性中不同基因型间各种生化指标的统计结果显示，KK基因型与RR和RK基因型间ApoB有显著性差异（P<0.05），其中KK基因型的相关脂蛋白B高于RR和RK基因型，其他生化指标在KK与RR和RK基因型间无显著性差异(P>0.05)。女性中KK基因型的各种生化指标与RR和RK基因型相比，除HDL和ApoA略高外，其他指标均略低，其中TG、VLDL在两组间差异有统计学意义（P<0.05）。男性KK基因型除HDL和ApoA比女性KK基因型的低外，其余TC、TG、VLDL、LDL等指标均比女性的高，但不同性别之间不同基因型的各种生化指标的差异均无统计学意义（P<0.05）。
3 讨论
人类ABCA1基因定位于9q31，包含有50个外显子，编码一种跨膜转运蛋白，ABCA1的主要功能就是参与胆固醇逆转运，即HDL将外周组织过多的胆固醇转运到肝脏的代谢过程。由于ABCA1促进细胞内的胆固醇和磷脂(主要是卵磷脂)转运至HDL前体apoAI，通过与ApoA作用促进新生HDL的形成，因此该蛋白在逆转运过程中起第一步限速作用[6]。许多临床和流行病学研究证实，脂质代谢紊乱参与并加速动脉粥样硬化的形成和发展，是冠心病的主要危险因素。HDL是唯一具有抗动脉粥样硬化的脂蛋白，其浓度与冠心病患病率呈明显的负相关，低HDL-C水平是冠心病的独立危险因素已被接受，本研究也发现，心血管疾病组HDL水平明显低于非心血管疾病组，但差异无统计学意义(P>0.05)，而其余血脂指标明显高于非心血管疾病组，其中TC、LDL与ApoB在两组间的差异有统计学意义(P<0.05)。
至今为止，已发现90多个与疾病相关的ABCA1基因突变或SNP位点，有报道ABCA1的个别杂合子突变可以降低HDL、增高TC和冠心病的发生率。此外，ABCA1基因的某些SNP可通过改变基因表达产物的活性或剂量，影响血脂水平或不同基因型个体对冠心病的易感性，Clee 等[3 ]报道的R219K不但与产生有益的血脂改变、降低动脉粥样硬化程度和减轻冠心病有关，而且变异发生较常见，提出K等位基因对于减少CAD的发生具有保护作用。其他研究也认为ABCA1 R219K与预防冠心病发生的保护作用密切相关[7]。ABCA1 R219 K是ABCA1 编码序列常见变异，它是第7号外显子1051位核苷酸发生G碱基替换成A碱基，219位精氨酸突变为赖氨酸，本研究采用PCR-RFLP方法对广西人群的R219K进行检测，结果发现广西汉族心血管疾病人群的RK型频率最高，RR型次之，KK型频率最低，虽然心血管疾病组的KK基因型频率（0.129）低于非心血管疾病组 (0.148)，但两组基因型及等位基因频率分布差异无统计学意义(P>0.05)。本研究心血管疾病组的R等位基因频率为0.634，K等位基因频率为0.366；与欧洲的研究结果相比，差异有统计学意义(P<0.05)[4]。说明ABCA1基因型和等位基因频率分布存在种族和个体差异，这种差异可能正是不同种族人群血脂水平和冠心病发病率不同的原因之一。
RR、RK和KK三种基因型的血脂水平差异没有统计学意义(P>0.05)。Zwarts[8]等在对该基因其他多态研究中也得出类似结论，并认为K等位基因对抗AS的作用并非表现为血浆HDL浓度升高。女性心血管疾病组观察到KK基因型的HDL比RR型的高(P>0.05)，而KK型的TG和VLDL比RR型低(P<0.05)，但在男性心血管疾病群体观察到的结果正好与女性群体的相反，但差异无统计学意义(P>0.05)。本研究心血管疾病组的KK基因型频率也低于非心血管疾病组，提示ABCA1基因R219K变异对心血管疾病可能具有保护作用，但具体保护机制尚不清楚，另外ABCA1 R219K在心血管疾病人群中基因型分布频率也有待于更大样本的观察和进一步深入研究。
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(收稿日期： 2007-08-03)
［责任编辑 王慧瑾 邓德灵］
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”