聂宇东，高金永，石凤翎，叶文兴
(内蒙古农业大学草原与资源环境学院/草地资源教育部重点实验室，呼和浩特 010018)
草地早熟禾(PoapratensisL.)是禾本科多年生冷季型草坪草草种，具有绿期长，耐践踏、耐修剪、质地优良、根茎繁殖能力强等特点，是世界公认的重要草坪草之一[1]，除了被应用于运动场外，还被广泛应用于水土保持、城市绿化、边坡防护等[2]。草坪草的生长离不开水分，水资源是限制草坪业发展的关键因素，干旱区域的草坪产业发展限制尤为突出。当草坪植物在干旱胁迫环境中表现出较差的草坪质量，充足的水分供应能够保障草坪的高质量[3]。然而草坪高耗水量是缺水地区草坪建植养护管理亟待解决的问题。
在逆境中，植物对环境能够做出应激反应，尽可能适应环境谋求生存，但是过度的胁迫打破植物天然的耐受限度而难以生存[4]。在干旱胁迫中，水分缺失会对植物造成伤害甚至死亡，其主要原因是植物生理代谢失调，渗透调节失衡所致[5]。为了提高植物的耐旱性，增强植物的渗透调节平衡功能，研究者们通过选育耐旱品种、施用外源化合物或施肥等其他方法来提高草坪草的抗旱性[6]。其中通过施用外源调节剂提高植物的耐旱性是最简单、快捷和有效的办法，如外源施加甜菜碱[7-8]、肌肽[9]和褪黑素等[10]。这些物质会广泛参与各种生理调节过程。在植物受到非生物胁迫时，抗氧化酶系能够降低植物受胁迫作用产生的氧自由基等活性氧有害物质的积累，延缓植物衰老或死亡进程。这些抗氧化酶其中包括CAT、POD、SOD等。CAT、POD、SOD对植物细胞的具有重要的保护作用，是植物抗性能力的重要指标。
肌醇(myo-inositol，MI)，学名环己六醇，是一种小分子化合物，易溶于水，能被植物吸收，参与植物的生长发育过程[11]。在植物细胞信号传导、生长素储存、细胞壁生物合成、相关胁迫分子的产生等过程中都起到重要作用[12]。目前，外源MI对草地早熟禾抗氧化酶系和渗透调节物质等生理代谢的作用尚不清楚，相关抗旱性研究较少。
在本研究中，通过外源MI喷施草地早熟禾茎叶，经过干旱胁迫比较不同浓度外源MI处理植株的抗性生理代谢差异，分析外源MI对草地早熟禾耐旱性的调节作用。为外源MI调控草地早熟禾抗旱性研究提供前期基础研究。
1.1 试验材料
试验材料选用草地早熟禾品种“肯塔基(Kentucky)”，肌醇选用myo-inositol(简写MI)，栽培基质为营养土、蛭石、石英砂。试验场地在内蒙古农业大学草地资源教育部重点实验室人工气候室。
1.2 试验方法
挑选健康、饱满的草地早熟禾种子，准备15个方盆(7 cm×7 cm)，栽培基质按照营养土和蛭石1∶1混合等量置于盆中，将等量种子均匀撒播于栽培基质上，种子上方由20～40目的石英砂覆盖，覆盖厚度约为0.5 cm。MI溶液设有0 mg·L-1、200 mg·L-1、400 mg·L-1、800 mg·L-1、1 600 mg·L-15个浓度梯度，每个MI浓度处理设3个重复。播种后进行浇水，盆中水分达到土壤饱和水状态(提起盆没有水滴出为宜)，在22℃～25℃，16 h光照/8 h暗条件下栽培管理，各个栽培盆保持土壤湿度基本一致。出苗后生长3周，草坪草高度在10～15 cm时，分别按照处理组在茎叶面喷施5个不同浓度的外源MI溶液，每日喷施2次(上午9时和下午17时)，连续喷施5 d。喷施MI处理后第6 d停止浇水，盆中基质所含水分逐日自然蒸发，其后进入干旱条件，在此停止浇水期间停止喷施外源MI。在停止浇水后观察草地早熟禾植株表型变化情况，并在出现明显表性变化后第5 d进行取样，测定相关生理代谢指标。
用游标卡尺测定取样草地早熟禾的根长、苗长，每个处理样本测量10株，3个重复样本。取草地早熟禾地上茎叶(苗)测定抗氧化酶类和渗透调节物质：过氧化氢酶(CAT)活性测定采用分光光度计法[13]，过氧化物酶(POD)活性的测定方法取用愈创木酚法[14]，超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定取用氮蓝四唑法[15]，丙2醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸法[16]，脯氨酸(Pro)的含量测定采用酸性茚三酮法[15]，可溶性糖(SS)含量的测定采用硫酸蒽酮法[17]，可溶性蛋白(SP)含量的测定采用考马斯亮蓝G250法[18]。数据利用Excel2019和SAS9.0统计软件进行单因素方差(ANOVA)分析。
2.1 外源MI对草地早熟禾表型的影响
由图1可以看出，在停止浇水第5 d时，通过表型观察发现草地早熟禾茎叶发生了明显的失水，在5个MI浓度梯度处理的样本中，喷施MI浓度为400 mg·L-1、800 mg·L-1的处理样本茎叶的绿色和直立性明显优于0 mg·L-1、200 mg·L-1、1 600 mg·L-1的处理样本，不同浓度MI喷施处理草地早熟禾茎叶的表型差异显著。对比0 mg·L-1处理样本，400 mg·L-1和800 mg·L-1处理样本受干旱胁迫影响较小，喷施200 mg·L-1和1 600 mg·L-1处理样本差异不明显。表型说明，喷施MI浓度在400～800 mg·L-1之间能有效提高草地早熟禾抗旱性，MI低于200 mg·L-1或高于1 600 mg·L-1浓度对草地早熟禾抗旱性作用不明显。
图1 不同浓度MI喷施草地早熟禾茎叶受干旱胁迫的表型
2.2 外源MI对草地早熟禾根和苗生长的影响
在停止浇水第5 d时测量植株的苗长和根长。由表1可以看出， 400 mg·L-1、800 mg·L-1MI处理样本分别比较于0 mg·L-1、200 mg·L-1、1 600 mg·L-1处理样本，根长和苗长分别差异显著(n=10，P﹤0.05)；
400 mg·L-1和800 mg·L-1处理的苗长和根长无显著差异；
0 mg·L-1、200 mg·L-1、1 600 mg·L-1处理的苗长存在显著差异，根长无显著差异(n=10，P﹤0.05)。结果表明，干旱胁迫过程中，400 mg·L-1和800 mg·L-1MI处理促进根和苗的生长，1 600 mg·L-1MI处理不利于苗的生长。
以上结果表明，在干旱胁迫时，喷施适量(400 mg·L-1和800 mg·L-1)MI能够延长草地早熟禾的绿期，促进植株的生长，缓解干旱对草地早熟禾的胁迫影响，有助于提高植株的耐旱性。但是，过高浓度(1 600 mg·L-1)外源MI处理对苗的生长有抑制，低浓度(200 mg·L-1)处理效果不明显。
表1 不同外源肌醇浓度处理草地早熟禾的苗长和根长
2.3 外源MI对草地早熟禾抗氧化酶系的影响
2.3.1外源MI对CAT的影响
如图2所示，喷施800 mg·L-1MI处理草地早熟禾茎叶，茎叶样本CAT活性明显高于其它处理样本，差异极显著(P<0.01)。400 mg·L-1处理茎叶样本CAT活性与0 mg·L-1和1 600 mg·L-1样本差异显著(P<0.05)。在0 mg·L-1、200 mg·L-1和1 600 mg·L-1处理样本之间，茎叶CAT酶活性无显著差异(P>0.05) ，在0～800 mg·L-1浓度范围内，CAT活性随MI浓度的增加而增强；
在800～1 600 mg·L-1浓度范围，CAT活性随MI浓度的增加而呈减弱趋势。结果表明，在5个MI浓度处理中，800 mg·L-1MI处理最有助于茎叶CAT活性增强，适当的MI处理有助于激活植株茎叶氧自由基清除酶类CAT 的活性。
图2 不同外源肌醇浓度处理草地早熟禾的CAT活性
2.3.2外源MI对POD的影响
如图3所示，喷施200 mg·L-1、400 mg·L-1、800 mg·L-1和1 600 mg·L-1MI处理的样本茎叶相比较0 mg·L-1的样本，POD活性分别提高了7.99%、39.96%、15.98%和12.02%，且分别与0 mg·L-1处理样本差异显著(P<0.05)。在干旱胁迫条件下， 0～400 mg·L-1范围MI处理样本的茎叶POD活性呈增强趋势，400～1 600 mg·L-1范围MI处理样本的茎叶POD活性呈减弱趋势。在5个浓度梯度中，喷施400 mg·L-1MI对草地早熟禾茎叶POD活性的作用最强。结果表明，外源MI处理有助于草地早熟禾茎叶POD活性增强，且POD活性受MI浓度影响显著。
图3 不同外源肌醇浓度处理草地早熟禾的POD活性
2.3.3外源MI对SOD的影响
草地早熟禾茎叶SOD在干旱胁迫作用下的活力如图4所示，在5个浓度处理中，以0 mg·L-1MI处理为对照，200 mg·L-1、400 mg·L-1、800 mg·L-1和1 600 mg·L-14个浓度MI处理样本的茎叶SOD活力差异极显著(P<0.01)，其SOD活力分别提高了65.79%、44.54%、72.95%和59.31%。从结果可以看出，SOD活力在 200 mg·L-1、400 mg·L-1、800 mg·L-1和1 600 mg·L-1浓度梯度没有增强或降低的明显规律趋势，但是外源MI对SOD的作用效果显著。由此可见，受干旱胁迫时，外源MI 处理的草地早熟禾茎叶SOD活力增强，有助于植物活性氧的清除，从而提高抗旱性。
图4 不同外源肌醇浓度处理草地早熟禾的SOD活性
2.4 外源MI对草地早熟禾渗透调节物质的影响
2.4.1外源MI对MDA的影响
丙二醛(MDA)是膜质系统过氧化的主要产物，MDA积累对细胞造成伤害，是植物逆境胁迫中重要的抗性生理指标。由图5A可以看出：在5个MI浓度处理样本中，400 mg·L-1和800 mg·L-1处理的样本茎叶MDA含量相比与其他3个浓度处理差异极显著(P<0.01)，且400 mg·L-1和800 mg·L-1MI处理的样本之间差异显著(P<0.05)；
200 mg·L-1、400 mg·L-1、800 mg·L-1和1 600 mg·L-1MI处理对比0 mg·L-1处理，茎叶MDA含量分别降低了6.82%、50.00%、36.36%和6.82%；
0 mg·L-1、200 mg·L-1、1 600 mg·L-1MI处理之间差异不显著(P>0.05)；
结果表明，在0～400 mg·L-1处理范围，MDA含量存在随MI浓度增加而降低的趋势；
在400～1 600 mg·L-1处理范围MDA含量存在随MI浓度增加而增加的趋势。
2.4.2外源MI对Pro的影响
脯氨酸(Pro)是植物响应寒、旱等逆境胁迫的重要渗透调节物质。植物处于干旱胁迫时，植物体内Pro含量增加，通过渗透调节作用抵抗干旱胁迫，以此来维持细胞的渗透平衡。因此，Pro含量是植物抗性能力的一项生理指标。通过测定干旱胁迫样本茎叶的Pro含量发现(图5B)：在5个MI浓度处理样本中，200 mg·L-1、400 mg·L-1、800 mg·L-1和1 600 mg·L-1MI处理对比0 mg·L-1处理样本的Pro含量分别降低了48.27%、66.67%、55.37%和54.10%，差异极显著(P<0.01)；
在800 mg·L-1和1 600 mg·L-1处理样本之间Pro含量差异不显著，其余处理之间均有显著差异(P<0.05)，400 mg·L-1MI处理样本的Pro含量最低；
0～400 mg·L-1梯度范围的Pro含量成逐渐降低趋势；
800 mg·L-1和1 600 mg·L-1相比较400 mg·L-1处理样本的Pro含量有显著增加(P<0.05)，且趋于稳定趋势。结果表明：喷施外源MI能够显著降低干旱胁迫时草地早熟禾茎叶的Pro含量，植物对干旱胁迫的敏感性下降，400 mg·L-1的浓度效果最佳。
2.4.3外源MI对SS的影响
可溶性糖(SS)在干旱胁迫作用下可在植物体内积累，通过调节细胞水势降低水分损失，SS是植物适应干旱胁迫的渗透调节物质[19]。在本研究中受干旱胁迫的处理样本SS含量如图5C所示：
200 mg·L-1、400 mg·L-1、800 mg·L-1和1 600 mg·L-1MI处理对比0 mg·L-1处理样本的SS含量分别降低了10.40%、52.13%、48.29%和25.30%，差异显著(P<0.05)；
400 mg·L-1和800 mg·L-1处理之间无显著差异，其余处理之间均有显著差异；
400 mg·L-1处理样本SS含量最低；
0～400 mg·L-1的SS含量成降低趋势，400～1 600 mg·L-1有增加趋势，这表明干旱胁迫条件下，SS含量随外源MI处理浓度的增加呈现先减少后增加的趋势。结果表明：外源MI能够调节草地早熟禾茎叶的SS代谢，SS含量受外源MI浓度的影响。
2.4.4外源MI对SP的影响
可溶性蛋白(SP)以小分子状态溶于水或其他溶剂，是植物重要的渗透调节物质和营养物质。SP增加和积累能提高细胞的保水能力，对细胞的生命物质及生物膜起到保护作用,干旱胁迫下植物体内SP可用于评估植物对抗逆环境的适应性[19-21]。通过测定干旱胁迫下5个MI浓度处理的草地早熟禾茎叶中SP含量发现(如图5D所示)：喷施800 mg·L-1MI处理的样本对比其他处理样本差异显著(P<0.05)，相对于0 mg·L-1处理样本SP含量增加了35.03%；
0 mg·L-1、200 mg·L-1、400 mg·L-1之间均无显著差异；
1 600 mg·L-1与200 mg·L-1和400 mg·L-1之间差异显著(P<0.05)，喷施1 600 mg·L-1对比800 mg·L-1处理样本SP含量减少了23.37%。结果表明，外源MI浓度在400 mg·L-1以下处理对SP的积累作用不明显，800 mg·L-1处理作用效果最显著，过高浓度(1 600 mg·L-1)也不利于SP的积累， 适量的外源MI处理有助于提高草地早熟禾抗旱性。
图5 干旱胁迫下不同肌醇浓度处理植株茎叶渗透调节物质含量
外源MI 添加处理常见于动植物组织培养基中，在食物营养配方中也常涉及，这是一种有助于生物体发育生长的营养成分[22-23]。本研究旨在通过外源MI不同浓度处理草地早熟禾，探究外源MI对草地早熟禾的抗旱性和相关抗性生理代谢的调节作用。本研究结果表明，外源喷施肌醇对草地早熟禾的抗旱性存在有效作用，这种有效作用与外源MI 的浓度相关。
本研究结果显示400 mg·L-1和800 mg·L-1MI喷施处理草地早熟禾茎叶对根和苗的生长有促进作用，相比较于0 mg·L-1处理对照差异显著，这与于明艳[24]等人研究结果一致。植物受到干旱等逆境胁迫的过程中，植物体内活性氧自由基积累，致使细胞膜系统受损造成细胞和植物衰老或死亡[25-26]。为应对这种不利的逆境胁迫，植物会通过抗氧化酶系统保护自身细胞免受损害，其中包括CAT、 POD、SOD等酶类，能有效清除活性氧自由基。在干旱等逆境胁迫下，草坪草的抗氧化酶活性越高，自由基清除与平衡能力就越强，抗逆性越强[27]。本研究结果显示，喷施外源MI处理草地早熟禾茎叶，有效提高CAT、POD、SOD3种酶的活性，其中400 mg·L-1和800 mg·L-1处理分别对POD和CAT活性影响极显著，SOD活力受外源MI作用敏感。这结果与LI等[28]研究结果一致，喷施外源MI 对草地早熟熟禾抗氧化酶的活性有促进作用，有助于植株体内活性氧的清除，减缓草地早熟禾的衰老或死亡。
在干旱胁迫过程中，渗透调节物质减缓植物细胞所受到的胁迫效应，保持细胞的完整性[29-30]。在植物抗旱性研究中，植物应对干旱胁迫时体内的MI积累[31]。有研究表明，干旱胁迫下，早熟禾细胞膜透性、脯氨酸和丙二醛(MDA) 含量显著增加[32]。本研究发现，外源MI处理的草地早熟禾在干旱胁迫过程中，400 mg·L-1和800 mg·L-1MI处理样本MDA含量显著降低，并且MDA含量积累受外源MI浓度梯度影响明显。据这个结果推测，喷施适宜浓度外源MI能够减弱干旱对草地早熟禾造成的膜脂过氧化反应，减缓MDA对草地早熟禾细胞所造成损害。相对于植物MDA含量降低，Pro含量的增加也能反映出植物抗逆敏感性。通常植物在干旱胁迫过程中Pro积累较多，以此维持细胞稳定性。本研究中测定处理样本茎叶Pro含量发现，喷施外源MI对草地早熟禾茎叶Pro含量的积累有抑制作用，低Pro含量并没有使得草地早熟禾茎叶枯萎，茎叶生长优于对照(0 mg·L-1MI)。这表明外源MI能够调节草地早熟禾对外界干旱胁迫的敏感性，对照(0 mg·L-1MI)样本对干旱响应敏感，体内Pro积累较多；
反之，MI处理的样本对干旱响应不敏感，体内Pro积累较少。从Pro在逆境中积累的途径来看，Pro积累既可能有适应性的意义，有可能是细胞结构和功能受损的表现，是一种伤害反应[33]。因此，Pro积累不一定表明植株耐旱性强。干旱胁迫中，草地早熟禾Pro积累受外源MI调节。SS的测定结果与Pro的结果类同：干旱胁迫条件下，草地早熟禾茎叶SS含量受外源MI的调节，MI处理抑制了SS的积累，降低了草地早熟禾对干旱胁迫的敏感性，并且400 mg·L-1和800 mg·L-1MI处理尤为明显。研究中还发现SP的含量变化与Pro、SS有所不同，SP的含量在800 mg·L-1MI处理样本中显著积累。这与样本表型一同表明，SP的积累有利于保持植物体内水分，延缓植物失水，800 mg·L-1MI处理有利于草地早熟禾保持水分抵抗干旱。结合这些渗透调节物质的结果表明，外源MI能够调节MDA、Pro、SS、SP的含量，影响草地早熟禾对干旱胁迫的敏感性，400 mg·L-1和800 mg·L-1MI对草地早熟禾干旱胁迫调节作用明显。
抗氧化酶CAT、POD、SOD和渗透调节物质MDA、Pro、SS、SP在干旱胁迫中起到了重要作用。喷施适宜浓度外源MI处理草地早熟禾茎叶，能够调节草地早熟禾抗氧化酶CAT、POD、SOD活性和渗透调节物质MDA、Pro、SS、SP含量，促进根和苗的生长，并且400 mg·L-1和800 mg·L-1浓度处理效果尤为显著。适宜浓度外源MI能有效提高草地早熟禾对干旱胁迫的防御能力。
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