王旭东，徐建洪，李志勇，王 珺，徐晓菲，常 阳
肺癌是临床最常见的恶性肿瘤，也是排名第一的肿瘤相关致死原因[1]。依据病理分型，肺癌分为小细胞肺癌(15%)和非小细胞肺癌(85%)，后者又分为三个亚型：肺腺癌、肺鳞状细胞癌和大细胞肺癌，其中肺腺癌占总体病例的40%左右[2]。据统计，男性和女性肺癌的5年生存率分别仅为15.5%和20.3%[3]。近年来，随着诊断和治疗技术的发展，尤其是靶向治疗的应用，肺癌的预后已经取得了一定的进步。但是由于缺乏特异性治疗靶点和肿瘤耐药等原因，肺腺癌患者的生存时间依然有待进一步延长。因此，开发针对肺腺癌的标志物和治疗靶点成为重要的研究任务。
热休克蛋白(heat shock protein，HSP)家族在进化上相对保守，根据分子量的不同，HSP蛋白家族可以分为五大家族：分别为HSP40、HSP70、HSP90、HSP105/110和小分子HSP家族等。研究表明，肿瘤细胞表面表达了大量的HSP，包括HSP40、HSP60和HSP70等[4]。在癌症的基因变异中，HSP家族能够稳定肿瘤变异的或异常表达的基因，向患者免疫系统提供信号，帮助肿瘤免疫逃逸[4]。HSPA4作为HSP70的一员，也广泛参与了多种肿瘤的发生和发展过程[5-8]。HSPA4 rs3088225(A>G)基因变异与铂化疗的肺癌患者生存率显著相关[9]。目前，HSPA4在肺腺癌中的研究较少，因此明确HSPA4在肺腺癌发生发展乃至转移中的作用具有重要意义。本研究应用生物信息学的方法，探讨HSPA4在肺腺癌发病中的作用，以期为肺腺癌的诊治提供新的思路。
1.1 数据资料获取 在TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下载肺腺癌、癌旁组织和正常组织的数据集，获得535例肺腺癌病例和59例正常肺组织mRNA表达谱、一般信息和临床资料。从GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载GSE43448和GSE10072数据集中的mRNA表达谱，分别采用Wilcoxon秩和检验比较HSPA4在肺腺癌组织和正常肺组织中HSPA4的表达差异情况。对HPA数据库(https://www.proteinatlas.org/)中抗体对肺腺癌和正常组织的染色强度进行综合评估，用于分析HSPA4在蛋白水平的表达情况[10]。
1.2 HSPA4表达与肺腺癌肿瘤分期的相关性及其诊断和预后价值 应用R包ggplot2分析HSPA4与肺腺癌肿瘤中包括TMN分期和病理分期指标的相关性。分别应用R包survival 并利用K-M图展示TCGA-LUAD数据集中HSPA4不同表达组的全因死亡率(overall survival，OS)、无进展生存期(progess free interval，PFI)和疾病特异性生存率(disease specific survival, DSS)，并以GSE13213数据集OS生存率进行验证。应用pROC包，timeROC包和survival包，分析HSPA4在肺腺癌中的诊断和预后价值。以列线图展示包括TNM分期、HSPA4表达在内的多种因素在肺腺癌1年、3年和5年预测价值。
1.3 HSPA4在肺腺癌中的基因变异 选取cBioportal数据库(www. cBioportal.org)中3个肺腺癌数据集，分别是Lung Adenocarcinoma(MSKCC,Science 2015)、Lung Adenocarcinoma (Broad ,Cell 2012)、 Lung Adenocarcinoma (TCGA, PanCancer Altas ) 分析HSPA4基因在肺腺癌中的变异情况[11]。
1.4 HSPA4基因中的DNA甲基化信息 基因甲基化是表观遗传学重要的基因表达调节方式，我们利用MethSurv数据库(https://biit.cs.ut.ee/methsurv/)分析TCGA-LUAD数据集中HSPA4基因甲基化情况，并且评价了HSPA4基因CpG甲基化在肺腺癌中的预后价值[12]。
1.5 HSPA4与肺腺癌肿瘤微环境中免疫细胞浸润和免疫检查点的关系 利用R包GSVA包分析了HSPA4与肺腺癌中多种免疫细胞浸润情况的相关性，同时考察了HSPA4在肺腺癌中的表达与免疫检查点CD274表达的相关性。
1.6 GO、KEGG和GSEA富集分析 应用STRING数据库(https://cn.string-db.org/)获得HSPA4蛋白互作网络，以评分大于0.9为标准[13]。应用GO、KEGG分析HSPA4及其相关基因的功能和通路富集分析。GSEA分析选择带注释的基因集(c2.cp.v7.2.symbols.gmt)作为参考数据集，每个分析运行1000次基因组排列，分析HSPA4相关基因富集通路。
1.7 统计学处理 应用R(v.3.6.3)平台分析数据，应用非参数秩和检验行两组间差异比较；
应用Spearman相关检验分析两因素相关性；
应用Kaplan-Meier曲线进行生存分析，组间生存率以Cox回归检验。均以α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 HSPA4在肺腺癌中mRNA和蛋白表达水平 在TCGA-LUAD数据集中，与正常肺组织(59例)(5.882±0.197)相比，肺腺癌组(535例)表达(6.184±0.537)显著升高(P<0.001)；
而与癌旁正常肺组织(59例)表达(5.882±0.197)相比，相对应的肺腺癌组(59例)表达(6.396±0.482)显著升高(P<0.001)。为了确认HSPA4在肺腺癌中的表达差异，我们在GSE43458和GSE10072两个数据集进行验证。在数据集GSE43458中，与正常肺组织(30例)表达(9.020±0.164)相比，肺腺癌组(80例)表达(9.241±0.385)显著升高(P<0.001)；
在数据集GSE10072中，与正常肺组织(49例)表达(8.425±0.295)相比，肺腺癌组(58例)表达(8.919±0.386)显著升高(P<0.001)。利用HPA数据库获得HSPA4在正常肺组织和肺腺癌组织中的表达情况：在HPA00023抗体组中正常肺组织均无染色；
而肺腺癌组织中中等染色4例(4/12)，低染色4例(4/12)，无染色4例(4/12)(图1)。
图1 热休克蛋白A4在正常肺组织(A)及肺腺癌(B)中的表达情况(免疫组化)
2.2 HSPA4高表达与肺腺癌分期的相关性 在T分期中，与正常肺组织相比，HSPA4表达在T1+T2+T3分期及T4分期显著升高，T4分期表达较T1+T2+T3分期明显升高(表1)。HSPA4表达与N、M及病理分期也显著相关(表1)。根据K-M曲线所示，HSPA4高表达的肺腺癌患者与低表达者相比具有更差的OS(P=0.004)、PFI(P=0.021)和DSS(P=0.012)(图2A-C)。我们利用GEO数据集GSE13213临床生存数据进一步证实HSPA4高表达组较低表达组的预后更差(OS，P=0.006)(图2D)。受试者工作曲线ROC图显示，曲线下面积AUC为0.810，表明HSPA4能够较好地区分肺腺癌肿瘤组织和正常组织；
时间依赖性ROC曲线1、3、5年曲线下面积分别为0.605、0.583、0.553(图3)。列线图展示了TNM分期、HSPA4等对肺腺癌患者1、3、5年生存率的预测，表明HSPA4具有一定的判断预后的作用(图4)。
表1 LUAD数据集中HSPA4表达与肺腺癌临床阶段的关系
2.3 HSPA4在肺腺癌中的基因改变情况 在cBioportal数据库中选取了3个数据集，分别是Lung Adenocarcinoma(MSKCC,Science 2015)、Lung Adenocarcinoma (Broad ,Cell 2012)、 Lung Adenocarcinoma (TCGA,PanCancer Altas)，共计784位患者。结果显示，HSPA4基因总体改变率为2.2%。
2.4 HSPA4基因在肺腺癌患者中DNA甲基化情况 MethSurv数据库分析13个CpG位点中cg05996250、cg0747441、cg10645426和cg11250576等4个探针甲基化程度较高，同时cg05996250(HR=1.526，P=0.014)、cg02067788(HR=1.526，P=0.022)、cg24159723(HR=0.692，P=0.021)等3个CpG位点探针显示HSPA4的高甲基化与肺腺癌的不良预后相关，具有统计学意义。
图2 肺腺癌患者HSPA4高表达组与低表达组的预后比较
图3 ROC曲线显示HSPA4对肺腺癌的诊断和预测价值
图4 列线图展示HSPA4水平与相关临床因素预测1、3、5年肺腺癌患者生存率
2.5 HSPA4表达与肺腺癌中免疫细胞浸润的相关性 在肺腺癌中，HSPA4表达与辅助性T细胞2(r=-0.282，P<0.001)、中央记忆型T细胞(r=0.154，P<0.001)、辅助性T细胞(r=0.135，P=0.002)等免疫细胞正相关；
而与B 细胞(r=-0.220，P<0.001)、浆细胞样树突状细胞(r=-0.187，P<0.001)、滤泡辅助性T细胞(r=-0.136，P-=0.002)、CD8 T细胞(r=-0.134，P=0.002)、细胞毒性细胞(r=-0.129，P=0.003)、CD56表达水平较高自然杀伤细胞(r=-0.119，P=0.006)、T细胞(r=-0.092，P=0.033)等免疫细胞呈负相关。同时我们考察了HSPA4在肺腺癌中与免疫检查点CD274之间的关系，结果显示HSPA4与CD274表达正相关，并具有统计学意义(r=0.144，P<0.001)(图5)。
图5 HSPA4表达与免疫检查点CD274表达的关系
2.6 GO、KEGG和GSEA通路富集分析 依据STRING数据库建立HSPA4蛋白互作网络，评分最高的10个相关蛋白为E3泛素蛋白连接酶CHIP(E3 ubiquitin-protein ligase CHIP，STUB1)、应激诱导的磷酸蛋白1(stress-induced-phosphoprotein 1，STIP1)、Hsc70相互作用蛋白(Hsc70-interacting protein，ST13)、α-突触蛋白(Alpha-synuclein，SNCA)、热休克蛋白90α(Heat shock protein HSP 90-alpha、HSP90AA1)、DnaJ同源亚家族B成员6(DnaJ homolog subfamily B member 6，DNAJB6)、Dnaj热休克蛋白40家族成员B1(Dnaj hsp40 member b1，DNAJB1)、BAG家族分子伴侣调节器1(BAG family molecular chaperone regulator 1，BAG1)、BAG家族分子伴侣调节器2(BAG family molecular chaperone regulator2，BAG2)、BAG家族分子伴侣调节器3(BAG family molecular chaperone regulator3，BAG3)，评分均大于0.99。KEGG通路富集分析显示HSPA4及相关除了参与细胞对热的反应等生物学过程外，还参与了抗原处理和提呈(hsa04612，antigen processing and presentation)等细胞通路。HSPA4与HSP90AA1在肺腺癌患者中表达呈正相关(r=0.564，P<0.001，图6)，同时HSP90AA1的高表达与肺腺癌患者的不良预后相关(P=0.009，图7)。GSEA通路富集分析显示：HSPA4及其相关蛋白被富集于FceRI介导的NF-κB活化(FCERI_MEDIATED_NF_KB_ACTIVATION)、FcgR3A 介导的IL10的合成(FCGR3A_MEDIATED_IL10_SYNTHESIS)、B细胞受体介导的B细胞信号通路(SIGNALING_BY_THE_B_CELL_RECEPTOR_BCR)、抗体激活B细胞受体导致的第二信使的产生(ANTIGEN_ACTIVATES_B_CELL_RECEPTOR_BCR_LEADING_TO_GENERATION_OF_SECOND_MESSENGERS)、FceRI介导的钙离子流通(FCERI_MEDIATED_CA_2_MOBILIZATION)、FCGR的活化(FCGR_ACTIVATION)、CD22介导的B细胞受体的控制等信号通路(CD22介导的B细胞受体调节)，并与上述通路负相关，具有统计学意义(NES<-1，校正P<0.05，FDR<0.25)。
图6 肺腺癌中HSPA4与HSP90AA1表达的关系
图7 HSP90AA1不同表达组在肺腺癌中的生存分析
研究表明，HSPA4表达于多种器官，且参与了包括肿瘤发生、发展在内的多种生物过程，作为HSP70家族成员之一，还具有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用[14]。在本研究中，我们利用TCGA和GEO数据确认了HSPA4在肺腺癌中较正常肺组织表达明显升高，并且以HPA数据库资料证实了HSPA4在蛋白水平的表达明显升高。HSPA4高表达与肺腺癌患者的TMN分期和病理分期等密切相关，HSPA4表达升高提示患者的预后更差。同时，HSPA4具有一定的诊断和预测能力，能够预测患者1、3和5年生存率，说明HSPA4具有成为肺腺癌诊断、治疗乃至预后的生物标志物和靶点的潜力。
包括突变和缺失等在内的基因变异与肿瘤的发生密切相关，因此我们利用cBioportal数据库资料研究了HSPA4基因变异与肺癌发生之间的关系，结果显示有2.2%的肺腺癌患者HSPA4基因发生了变异。DNA甲基化也是影响肿瘤发生发展重要的因素之一，因此我们利用MethSurv数据库资料研究了HSPA4基因DNA甲基化情况，结果提示包括cg02067788、cg24159723、cg05996250在内的CpG位点甲基化水平升高与肺腺癌患者的不良预后密切相关，其中cg05996250探针CpG位点甲基化水平也是最高的。
目前肺腺癌的治疗手段包括手术、放疗、化疗和靶向治疗等，免疫治疗作为一种新的治疗手段，近年来越来越受到关注[15]。在肺部肿瘤微环境中大约2/3的免疫细胞是T和B细胞[16]。对肺癌浸润性T细胞的影响已经进行了广泛的研究，肺癌最成功的免疫治疗方法是阻断浸润肿瘤的T细胞上调的抑制性受体——免疫检查点的抗体，从而增强患者的T细胞对肿瘤细胞的作用[17]。然而，只有一部分患者对这些药物表现出持久的反应，而且治疗耐药性也很常见。新的证据表明，B细胞在肿瘤微环境中不仅仅是一个旁观者，它也具有关键的作用，然而这种作用可能是特定的，由于B细胞由不同的亚型组成，具有独特的效应功能，可能导致抗肿瘤或促进肿瘤的效果。因此，各种B细胞亚型之间的平衡会影响B细胞对肿瘤免疫的净影响[18]。本研究表明，HSPA4与B细胞、CD8+T细胞、细胞毒性细胞、T细胞等重要的免疫细胞均呈负相关，提示HSPA4的表达可能与肿瘤微环境中的免疫抑制具有密切关系。CD274为程序性死亡蛋白配体1(PD-L1，CD274)已被确定为免疫抑制受体编程性死亡-1(PD1/PDCD1)配体，并已证明在诱导和维持肿瘤免疫耐受中发挥关键作用[19, 20]。本研究表明，HSPA4的表达与CD274正相关，进一步提示HSPA4在肺腺癌肿瘤免疫耐受中发挥了重要作用。
本研究进一步利用GO、KEGG和GSEA数据库分析HSPA4相关基因在肺腺癌发病中的作用机制，HSPA4及其相关基因不仅参与了对热等不良刺激的反应，而且还富集于抗原提呈过程、FceRI介导的NF-κB活化、FcgR3A 介导的IL-10的合成、B细胞受体介导的B细胞信号通路、B细胞活化第二信使通路、FceRI介导的钙离子流通、FCGR的活化、CD22介导的B细胞受体的控制等信号通路，并对上述通路负调节，进一步提示HSPA4在肺腺癌肿瘤形成过程中参与了肿瘤免疫抑制和免疫逃逸等。
本研究明确了HSPA4在肺腺癌中高表达，且与肿瘤发生、发展、诊断乃至预后具有密切的关系，同时HSPA4的高表达还与肿瘤微环境中的免疫逃逸等具有密切的关系。由此我们认为，HSPA4可能具有作为肺腺癌新的肿瘤标志物和治疗靶点的潜力，值得我们进一步的深入研究。
猜你喜欢甲基化腺癌通路益肺解毒方联合顺铂对人肺腺癌A549细胞的影响中成药(2018年7期)2018-08-04HIF-1a和VEGF-A在宫颈腺癌中的表达及临床意义西南军医(2016年3期)2016-01-23Kisspeptin/GPR54信号通路促使性早熟形成的作用观察中国病理生理杂志(2015年8期)2015-12-21proBDNF-p75NTR通路抑制C6细胞增殖医学研究杂志(2015年3期)2015-06-10GSNO对人肺腺癌A549细胞的作用中国当代医药(2015年17期)2015-03-01通路快建林翰：对重模式应有再认识创业家(2015年1期)2015-02-27鼻咽癌组织中SYK基因启动子区的甲基化分析现代检验医学杂志(2015年2期)2015-02-06胃癌DNA甲基化研究进展沈阳医学院学报(2014年4期)2014-12-27老年胃腺癌中FOXO3a、PTEN和E-cadherin表达的关系西南军医(2014年5期)2014-04-25基因组DNA甲基化及组蛋白甲基化遗传(2014年3期)2014-02-28