黄治国 蒲领平 任志强 程国富 邓 杰
(1. 四川轻化工大学酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川 宜宾 644000；
2. 四川宇晟酒业投资管理有限公司成都分公司，四川 成都 610000)
米酒是中国的传统发酵酒。由于富含氨基酸、维生素、有机酸及矿物质等成分，米酒一直被当成一种滋补食品[1-2]。目前大多数新型米酒还处于研究和开发阶段，能够在市场中畅销的并不多[3]。益生菌具有改善人体肠道菌群结构[4]、削弱致癌因子、降低胆固醇[5-6]、提高人体免疫力的功能[7-8]。随着对益生菌保健功能的认识以及益生机理的不断揭示，益生菌相关食品的开发成为目前食品领域的研究热点。在米酒发酵中添加具有某些特性的益生菌，可提高其营养价值、改良其风味。
乳酸菌(LAB)是对人体健康有益的益生菌，多用于生产发酵乳制品[9-11]，而在酒类酿造中的应用较少。乳酸杆菌由最初的浸米过程中产生，到随着酒曲的接入以及酿造过程中随着米酒发酵条件变化而产生，乳酸杆菌在米酒的酿造过程中无处不在，其在米酒酿造过程中产生的乙酯类化合物则是米酒中重要的香气物质[12]。因此，乳酸杆菌对米酒发酵具有重要影响。而目前将益生乳酸杆菌应用到米酒生产的研究鲜见报道。
研究拟探讨6种益生菌乳酸杆菌(鼠李糖乳杆菌BV-77、干酪乳杆菌CS-773、发酵乳杆菌TSF-331、唾液乳杆菌AP-32、约氏乳杆菌MH-68、嗜酸乳杆菌TYCA-06)在只添加糖化酶、同时添加糖化酶和酵母以及不同的添加方式下对米酒发酵效果的影响，通过对益生菌菌粉与益生菌麸曲发酵米酒的酒精度、还原糖、总酸及感官评分结果进行对比，以期找到最适宜酿造米酒的益生菌，为生产优质新型米酒提供依据。
1.1 材料与试剂
糯米、麸皮：市售；
糖化酶：酶活力为 4万U/g，江苏博立生物制品有限公司；
酒精活性干酵母：成都醇中醇酒曲有限公司；
益生菌菌粉：鼠李糖乳杆菌BV-77、发酵乳杆菌TSF-331、唾液乳杆菌AP-32、约氏乳杆菌MH-68、嗜酸乳杆菌TYCA-06、干酪乳杆菌CS-773，安徽锦乔生物科技有限公司；
磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、乙酸钠、葡萄糖、酒石酸钾钠、氢氧化钠、硫酸、苯酚、柠檬酸氢二铵：分析纯，成都市科隆化学品有限公司。
1.2 主要仪器设备
生化培养箱：LRH-150-B型，广东泰宏君科学仪器股份有限公司；
立式自动压力蒸汽灭菌锅：CI54DS型，致微(厦门)仪器有限公司；
电热恒温培养箱：DH4000B2型，天津市泰斯特仪器有限公司；
干燥箱：LS-0610型，杭州乐乾科学仪器有限公司；
紫外可见分光光度计：UV-1200型，上海翱艺仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 益生菌麸曲制作 称取50.00 g麸皮于500.00 mL三角瓶中，加入50.00 mL去离子水，灭菌后分别添加6种益生菌菌粉1.00 g，在28 ℃培养4～5 d，于40 ℃烘干并打碎，可制成相应的益生菌麸曲。
1.3.2 不同米酒的酿造工艺流程
操作要点：
(1) 糯米挑选：原料要求颗粒饱满，无虫蛀、无霉变、无其他杂质。
(2) 洗米、浸米：每份取300.00 g糯米，淘洗干净后浸泡4～5 h，直到糯米可以揉碎即可。
(3) 蒸饭：用高压蒸汽锅蒸40.00 min左右。
(4) 淋冷：将蒸好的饭放于摊凉的容器中，加入70.00～80.00 ℃的热水，边拌边淋，使米饭快速降温至35.00 ℃左右，避免因缓慢冷却导致微生物污染。
(5) 加菌加酵母：
益生菌麸曲米酒：益生菌麸曲添加量为0.80%，糖化酶用量为200 U/g，活化后加至米饭中，搅拌和匀。
益生菌菌粉米酒：添加益生菌菌粉1.00 g，200 U/g的糖化酶于米饭中搅拌均匀。
只在研究酵母对益生菌麸曲米酒或益生菌菌粉米酒的影响时，添加0.04%的酵母(以原料的干重计)，在酿造益生菌麸曲米酒和益生菌菌粉米酒时不添加酵母。
(6) 糖化发酵：将加曲后的糯米装入发酵罐中，搭成喇叭型的凹窝，用保鲜膜密封发酵，置于28.00 ℃的培养箱中培养3 d。
(7) 过滤：用4层纱布过滤醪糟得到原液成品米酒，后续可用于理化分析和感官评价。
(8) 煎酒：60.00 ℃灭菌30.00 min。
1.3.3 理化指标测定
(1) 酒精体积分数：按GB/T 15038—2006的酒精计法执行。
(2) 还原糖：3, 5-二硝基水杨酸法[13]。
(3) 总酸：按GB/T 13662—2008的氢氧化钠滴定法执行。
1.3.4 感官分析 采用定量描述分析法对益生菌米酒的香气成分进行评价。感官培训参照文献[14-15]，选择10位经过培训的感官品评员(5男5女)在独立的品评间进行品评，米酒的基本口感特征评价按照5点标度法，分别对酸、甜、苦、鲜和涩味打分，0～5分别表示感觉强烈程度逐渐增大，最终评分取平均值。
1.3.5 数据处理 每组试验均重复3次，试验结果均用“平均值±标准偏差”表示，用SPSS 22.0统计软件进行分析。
2.1 益生菌米酒和益生菌麸曲米酒理化性质的比较
2.1.1 酒精含量 为了研究添加酵母对6种益生菌米酒和益生菌麸曲酿造米酒酒精含量的影响，结果发现添加酵母可显著提高这两种米酒的酒精含量。如图1(a)所示，添加酵母后嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌酿制的米酒的酒精含量分别提高了24.39%，21.43%，18.85%；
如图1(b)所示，唾液乳杆菌、干酪乳杆菌麸曲酿制的米酒的酒精含量分别提高了33.33%，26.67%；
而约氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌麸曲酿制的米酒酒精含量仅提高了2.00%左右，可能因为这些菌种在发酵过程产生了乳酸及营养竞争等原因影响了酵母酒精发酵的过程[16]。
字母不同(只加糖化酶组：大写字母;添加糖化酶和酵母组：小写字母)表示不同益生菌米酒的差异显著(P<0.05)；
“*”表示同种益生菌不同组米酒的差异显著(P<0.05)
2.1.2 还原糖的比较 由图2可知，加入酵母可提高米酒的还原糖含量；
其中，鼠李糖乳杆菌酿制的米酒还原糖含量最多，显著高于其他各组(P<0.05)，可能是因为鼠李糖乳杆菌能在短时间内降解原料中的淀粉产生更多的还原糖[17]。如图2(b)所示：还原糖含量提高最多的是发酵乳杆菌麸曲酿制的米酒，提高了18.37%，而约氏乳杆菌麸曲酿制米酒的只提高了0.36%，可能是由于发酵时间较短，糖类还未转化成酒精，导致不同益生菌对糖类转化为酒精和有机酸的影响不同。
字母不同(只加糖化酶组：大写字母;添加糖化酶和酵母组：小写字母)表示不同益生菌米酒的差异显著(P<0.05)；
“*”表示同种益生菌不同组米酒的差异显著(P<0.05)
2.1.3 总酸含量的比较 由图3可知，添加酵母后大部分米酒总酸含量均有所下降。添加酵母后，利用发酵乳杆菌酿制米酒的总酸含量下降最多，而唾液乳杆菌、嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌麸曲酿制的米酒的总酸含量分别降低了12.06%，9.24%，6.20%。而约氏乳杆菌酿制米酒、干酪乳杆菌麸曲酿制米酒的总酸含量却分别提高了7.84% 和7.54%，可能由于这两种菌在发酵过程中能发酵碳水化合物产生乳酸，且具有良好的产酸特性以及抗逆性[18-19]。
字母不同(只加糖化酶组：大写字母;添加糖化酶和酵母组：小写字母)表示不同益生菌米酒的差异显著(P<0.05)；
“*”表示同种益生菌不同组米酒的差异显著(P<0.05)
2.2 益生菌添加方式对米酒发酵的影响
2.2.1 酒精含量 由图4可知，在不同添加方式下得到的米酒酒精含量有所差异。除鼠李糖乳杆菌外，只添加糖化酶的益生菌菌粉酿造的米酒酒精含量高于益生菌麸曲的，可能是鼠李糖乳杆菌麸曲的糖化能力较强，使得原料中的淀粉酶解为还原糖的含量增加，导致发酵产生的酒精含量高[20]；
与只添加糖化酶相比，酵母的添加可提高米酒酒精含量，并且添加益生菌菌粉比添加益生菌麸曲效果更好。研究[21]表明，酿造米酒酒精度一般在5.00%～14.00%vol，结合2.1.1发酵试验，进一步证实了发酵乳杆菌菌粉、干酪乳杆菌菌粉、唾液乳杆菌菌粉更适宜酿造米酒。
字母不同(益生菌麸曲组：大写字母;益生菌菌粉组：小写字母)表示不同益生菌样品之间差异显著(P<0.05)；
“*”表示同种益生菌不同添加方式的米酒的差异显著(P<0.05)
2.2.2 还原糖含量 由图5(a)可知，益生菌菌粉酿造的米酒的还原糖含量总体上高于益生菌麸曲酿造的米酒；
相比益生菌菌粉酿造的米酒，唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌麸曲酿造米酒的还原糖含量有所提高，可能是因为麸曲的糖化能力加强使得原料中淀粉质的转化率提高，进而在短时间内产生了更多的还原糖[22]；
而其他菌种的还原糖含量却有所下降，可能是糖类转化成了甘油和有机酸。由图5(b)可知，在相同的发酵条件下，鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、干酪乳杆菌菌粉酿造的米酒的还原糖含量显著高于其麸曲酿造的(P<0.05)，其他几种菌株相反。表明益生菌的加入对米酒的还原糖含量有一定影响，产糖的含量根据益生菌自身的特性而定。
字母不同(益生菌麸曲组：大写字母;益生菌菌粉组：小写字母)表示不同益生菌样品之间差异显著(P<0.05)；
“*”表示同种益生菌不同添加方式的米酒的差异显著(P<0.05)
2.2.3 总酸含量 如图6(a)所示，在只加糖化酶的条件下，益生菌菌粉酿造的米酒总酸含量均有显著差异(P<0.05)；
添加唾液乳杆菌菌粉米酒的总酸含量最高(14.30 mL/L)，而约氏乳杆菌麸曲米酒的总酸含量最低(9.20 mL/L)。如图6(b)所示，同时添加酵母和糖化酶时，不同添加方式下米酒的总酸含量均有所提高，可能是酵母菌呼吸作用产生的二氧化碳促进了同一环境下乳酸杆菌的生长[23]，乳酸杆菌进一步通过戊糖磷酸途径产生乳酸[24]，导致总酸含量增加；
添加发酵乳杆菌菌粉米酒的总酸含量最低(8.40 mL/L)，且在口感上酸甜适口；
结合上述发酵试验结果来看，发酵乳杆菌菌粉在同时加糖化酶和酵母的添加方式下酿出的米酒最佳。
字母不同(益生菌麸曲组：大写字母;益生菌菌粉组：小写字母)表示不同益生菌样品之间差异显著(P<0.05)；
“*”表示同种益生菌不同添加方式的米酒的差异显著(P<0.05)
2.3 感官评价
分别对酒样的酸、甜、苦、鲜、涩5种主要口感特征进行强度打分，不同种类益生菌发酵的米酒感官评价雷达图见图7。各米酒样品的口感特征差别较大，发酵乳杆菌与嗜酸乳杆菌酿制米酒的各项评分均较为接近，唾液乳杆菌和约氏乳杆菌的感官得分较低，可能与酿造条件有关，导致给米酒风味造成负面影响。总体来看，采用发酵乳杆菌发酵米酒时酒体自然清香，无异味，甜酸适口，醇正绵和，具米酒特有的风味。因此，确定发酵乳杆菌为开发益生菌米酒的最佳菌种。
图7 感官分析雷达图Figure 7 Radar map of sensory analysis
研究了添加酵母及不同益生菌添加方式对米酒品质的影响，通过对米酒的酒精度、还原糖、总酸和感官评分进行比较分析，得出添加1.00 g发酵乳杆菌菌粉、0.04%酵母和200 U/g糖化酶酿造的米酒效果最好，其酒精度为7.20%vol，还原糖含量为270.00 mg/mL，总酸含量8.40 mL/L，且口感较浓郁。乳酸杆菌与酵母混合发酵能提高食品的益生特性，其中添加发酵乳杆菌的益生菌酸奶的感官得分很高。后期可对发酵乳杆菌的性能及在米酒发酵工艺中的应用进一步研究验证。
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