王伟霞,李舒格,张之麒 ,陈金日,吴少杰，李福后
(江苏海洋大学 a.江苏省海洋生物资源与环境重点实验室；
b.江苏省海洋生物技术重点实验室；
c.江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，江苏 连云港 222005)
三苯甲烷类染料是一类芳香族异源化合物，具有色谱范围广、着色力高等优点，被广泛应用于纺织、印染、医药等行业[1-2]。该类染料以三苯甲烷为母体，结构较为复杂，生物可降解性低，并且对动物细胞具有毒性，可产生致癌、致畸、致突变等作用[3-7]。孔雀石绿属于三苯甲烷类染料，除了作为染料外，曾经广泛应用于水产养殖业，对环境和人类健康造成极大危害[8-10]。
目前，主要通过传统的物理化学方法来进行染料处理，如吸附、沉淀、光解、氧化还原反应、电化学处理等。然而，这些传统方法成本非常昂贵且可能带来二次污染[11-12]。作为传统物理化学方法的替代，生物降解具有成本低、环境友好等优点，正在成为一种有效的、可持续的处理方法。目前，已经发现多种微生物对三苯甲烷类染料具有脱色和降解能力，包括细菌、白腐真菌、放线菌和藻类等[13]。生物降解的研究主要集中于染料的脱色还原过程，如孔雀石绿和结晶紫被转化为无色衍生物的机制等[14]。
白腐真菌具有较强的染料脱色和降解能力，这得益于它们能够产生一系列的降解相关酶类，包括漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和细胞色素P450单加氧酶等[15-17]。漆酶是一类含铜的多酚氧化酶，具有广泛的底物特异性，其不仅能够利用氧作为电子受体来氧化木质素，还能够氧化多种芳香族化合物[15]。木质素过氧化物酶作为一种含血红素辅基的氧化还原酶，通过自由基链式反应，实现染料的脱色和降解过程[16]。在土生真菌绮丽小克银汉霉(Cunninghamellaelegans)中，细胞色素P450单加氧酶系统通过介导还原和N-脱甲基反应，实现孔雀石绿的生物转化[17]。
工业染料废水成分复杂，处理成本高。而将白腐真菌用于工业废水处理具有明显的优势，它们的菌丝体可以固定化，实现体系的连续循环处理，另外，处理后的菌丝体也方便回收，避免二次污染。滑菇(Pholiotanameko)属球盖菇科鳞伞属，作为一种白腐真菌，它可以引起木材腐朽等[18]。对于滑菇的研究，多数学者关注的是栽培技术的开发和多糖的利用等，而在染料脱色和降解方面的研究尚不多见[19-20]。本文以孔雀石绿、结晶紫、碱性品红等三苯甲烷类染料为底物，首先检测了滑菇菌丝体在含染料PDA培养基上的生长能力，然后研究了滑菇菌丝体在液体条件下对3种染料的脱色能力，同时，监测其产生漆酶、木质素过氧化物酶以及锰过氧化物酶的能力。该研究可为滑菇的工业化应用提供理论基础。
1.1 供试材料
1.1.1 菌株 滑菇菌株SP02，保存于江苏海洋大学食品科学与工程学院农业资源开发与农产品加工实验室。
1.1.2 试剂 ① 孔雀石绿、结晶紫、碱性品红、2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、黎芦醇等均为国产分析纯，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。② 染料母液：称取50 mg染料(孔雀石绿、结晶紫、碱性品红)，溶于10 mL去离子水，配置成5 g/L母液。
1.1.3 培养基 ① 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)：马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。② 马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB培养基)：马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，蒸馏水 1 000 mL，pH自然。③ 含染料PDA培养基：取500 mL灭菌后的PDA培养基，加热融化，待冷却至50 ℃左右时，分别加入5 mL不同类型的染料母液，混合均匀后倒至平板，制成含50 mg/L染料的PDA培养基。
1.2 方法
1.2.1 滑菇菌种活化 无菌操作条件下，从保藏的滑菇斜面菌种中挑取一小块直径约5 mm的菌块，接种于PDA平板培养基中，25 ℃培养8 d，备用。
1.2.2 滑菇在含染料PDA培养基上的生长试验 利用打孔器，从活化的PDA平板菌落近边缘处选取菌种块(直径5 mm)，分别接种于含有不同染料的PDA培养基中，25 ℃培养，并观察拍照，测量菌落直径。以不含染料的PDA培养基作为对照。
1.2.3 滑菇对染料的脱色试验 从活化的PDA平板菌落近边缘处选取菌种块(直径5 mm)，接种于含有100 mL PDB培养基的三角瓶中，每瓶接种5块。25 ℃，180 r/min振荡培养7 d，此为种子液。取12.5 mL种子液，接种于含有250 mL PDB培养基的三角瓶中，接种量为5%。25 ℃，180 r/min振荡培养7 d，此为菌丝体发酵液。
在滑菇菌丝体对染料的脱色试验中，首先取培养7 d的20 mL菌丝体发酵液，然后分别加入80 mL含有1 mg不同染料(孔雀石绿、结晶紫、碱性品红)的蒸馏水，使染料的终质量浓度均为10 mg/L。脱色试验的体系为100 mL，将脱色体系置于恒温摇床，25 ℃，120 r/min振荡培养，检测滑菇24 h的脱色能力。
1.2.4 滑菇的连续脱色试验 以孔雀石绿为滑菇的连续脱色对象。取培养7 d的20 mL菌丝体发酵液，加入80 mL含有1 mg孔雀石绿的蒸馏水，使孔雀石绿终质量浓度为10 mg/L。连续脱色试验的体系为100 mL，将脱色体系置于恒温摇床，25 ℃，120 r/min振荡培养。每隔24 h，添加10 mg/L孔雀石绿，连续添加3次，检测滑菇的连续脱色能力。
1.2.5 脱色率测定 从上述脱色体系中，取1 mL菌丝体染料混合液，12 000 r/min离心5 min，保留上清液。取上清液300 μL于96孔板中，利用酶标仪，扫描其在300～800 nm范围内的吸光度值(OD)。
孔雀石绿、结晶紫、碱性品红的最大吸收波长分别为615，584和542 nm[21]。在最大吸收波长处，测定上清液的OD值；
At为染料脱色t时刻的OD值，A0为染料脱色零时刻的OD值，脱色率DR=(A0-At)/A0×100%。
1.2.6 滑菇漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的活力测定 取25 ℃，180 r/min振荡培养7 d的菌丝体发酵液，4 ℃，12 000 r/min离心5 min，上清液即为粗酶液。
漆酶酶活测定：1 mL反应体系中，含10 mmol/L ABTS 100 μL，50 mmol/L乙酸缓冲液(pH 5.0)880 μL，粗酶液 20 μL。反应温度为25 ℃，3 min后在420 nm处测定OD值[22]。420 nm处ABTS氧化产物的摩尔消光系数(ε420 nm)为36 000 L/(mol·cm)，以每min内1 μmol ABTS被氧化所需的酶量为1个酶活单位(U)。
木质素过氧化物酶酶活测定：1 mL反应体系中，含20 mmol/L藜芦醇 100 μL，50 mmol/L酒石酸缓冲液(pH 3.5)870 μL，粗酶液 20 μL，10 mmol/L H2O2溶液10 μL。反应温度为25 ℃，3 min后在310 nm处测定OD值[22]。310 nm处藜芦醛的摩尔消光系数(ε310 nm)为9 300 L/(mol·cm)，以每min内1 μmol藜芦醇被氧化所需的酶量为1个酶活单位(U)。
锰过氧化物酶酶活测定：1 mL反应体系中，含8 mmol/L 愈创木酚 50 μL，50 mmol/L乳酸钠缓冲液(pH 4.5)870 μL，10 mmol/L MnSO450 μL，粗酶液 20 μL，10 mmol/L H2O2溶液10 μL。反应温度为25 ℃，3 min后在465 nm处测定OD值[23]。465 nm处四邻甲氧基连酚的摩尔消光系数(ε465nm)为26 600 L/(mol·cm)，以每min内1 μmol愈创木酚被转化所需的酶量为1个酶活单位(U)。
1.2.7 数据处理 各组实验数据重复3次，利用SPSS 26 软件进行统计分析，利用Excel 2021进行图谱绘制。
2.1 滑菇在含染料PDA培养基上的生长结果
由图1可知，滑菇菌丝体在不同培养基上的生长表现不同。在PDA培养基上(对照组)，菌丝体生长旺盛，菌丝较稠密，一般于14 d即可长满整个平板(90 mm)。在含有孔雀石绿和结晶紫的培养基上，菌丝体生长较缓慢，表明孔雀石绿和结晶紫具有较强的杀真菌能力。50 mg/L的孔雀石绿和结晶紫能够抑制菌丝的生长，培养14 d时，菌落直径一般为45～50 mm，且菌丝稠密。与孔雀石绿和结晶紫相比，品红对滑菇菌丝体的生长抑制能力较弱，培养14 d时，菌落直径一般为80～85 mm，且菌丝较稀疏。
图1 滑菇SP02在含染料PDA培养基上的生长结果
2.2 滑菇对染料的脱色试验结果
孔雀石绿在615 nm和425 nm处有两个特征吸收峰，经过24 h 的脱色，这两个吸收峰基本消失(如图2a所示)。结晶紫和碱性品红的最大吸收波长分别为584 nm和542 nm，经过24 h 的脱色，300～800 nm范围内的吸收峰也基本消失(如图2b和图2c所示)。滑菇菌株SP02对孔雀石绿、结晶紫和碱性品红等染料具有较强的脱色能力，24 h 脱色率分别达到92.9%，89.6%和83.9%(如图2d所示)。
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2.3 滑菇的连续脱色试验结果
以孔雀石绿为滑菇的连续脱色对象，在100 mL脱色体系中每隔24 h添加10 mg/L孔雀石绿，连续添加3次，检测滑菇的脱色能力。由图3可知，滑菇菌株SP02能够很好地对孔雀石绿进行连续脱色，具有良好的生产应用价值。
图3 滑菇SP02的连续脱色试验结果
白腐真菌主要通过生物吸附和生物降解两个过程对染料进行色度脱除。生物吸附主要通过菌丝体与染料相互作用所致，而生物降解主要涉及3种木质素降解酶系，包括漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶等[24]。滑菇菌株SP02能够对孔雀石绿进行连续脱色，表明生物降解作用可能在染料脱色过程中起重要作用。
2.4 滑菇漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的活力分析
白腐真菌主要通过分泌漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶等来氧化芳烃类化合物，使芳烃类化合物开环并实现完全降解[25]。测定了滑菇菌株SP02培养7 d的发酵液中3种木质素降解酶的活力，结果见图4。在培养7 d的发酵液中，漆酶的活力最高，为224 U/mL；
其次为木质素过氧化物酶，为58 U/mL；
锰过氧化物酶的活力最低，只有6 U/mL。在滑菇脱色体系中，推测漆酶和木质素过氧化物酶起协同作用，共同促进孔雀石绿的降解。Kang等[22]研究发现，在血红密孔菌IUM0032(Pycnoporuscoccineus)降解孔雀石绿的过程中，木质素过氧化物酶在降解初期起着关键作用，而漆酶进一步促进了孔雀石绿的降解。
图4 滑菇SP02漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的活力分析
利用白腐真菌进行染料的脱色具有明显的优势，通过菌丝体与染料大分子相互作用，以及菌丝体分泌的木质素降解酶系，不仅可以实现生物吸附，且能够实现良好的生物降解[24]。据报道，黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)、落叶松附毛孔菌(Trichaptumlaricinum)、裂褶菌(Schizophyllumcommune)等具有较强的染料脱色能力[26-29]。以黄孢原毛平革菌为例，该菌能够降解多种染料类型，包括三苯甲烷类、偶氮、蒽醌等[30]。韩启灿等[28]发现，落叶松附毛孔菌对孔雀石绿有较强的脱色作用，在适宜条件下脱色1 h，脱色率可达92.6%。裂褶菌cfcc7252在好氧和厌氧条件下均能高效降解孔雀石绿，48 h内降解率可达98%以上[29]。滑菇菌株SP02 对孔雀石绿也有较强的脱色和降解能力，24 h内其脱色率为92.9%。不同的菌株类型对孔雀石绿等染料的降解和脱色能力略有差异，这可能与菌株的培养条件、产降解酶水平密切相关。
漆酶和木质素过氧化物酶是参与染料降解的主要作用酶类，优化产酶条件，提高酶的产量并进行大规模推广应用是研究的重点方向之一。尚晓静等[25]发现，裂褶菌菌株G18的漆酶在液体培养的第6天达到峰值，为1 830 U/mL，而木质素过氧化物酶在第2天即达到峰值。在毛木耳菌株AC5培养7 d的发酵液中，漆酶和木质素过氧化物酶的活性分别为321 U/mL和121 U/mL，此时菌株对染料的降解率最高[31]。滑菇菌株SP02能够分泌漆酶、木质素过氧化物酶等，在发酵培养7 d时，酶活性分别为224 U/mL和58 U/mL。与上述裂褶菌和毛木耳菌株相比，滑菇菌株SP02的产降解酶水平较低，这可能与菌种类型、培养条件等相关，需要进一步优化产酶条件，提高酶的表达水平。
刘晓雪等[32]以平菇680为研究材料，采用响应面法优化了产漆酶的培养条件，结果表明响应面设计对于优化液体培养基组成以提高漆酶活性切实可行。利用基因工程手段，克隆表达白腐真菌漆酶和木质素过氧化物酶基因，以提高酶的表达量并改善酶学性质，将进一步推动木质素降解酶类的工业化应用[33-34]。
本研究以孔雀石绿、结晶紫、碱性品红为底物，发现滑菇菌株SP02能够有效降解这3种三苯甲烷类染料，同时，菌株SP02能够对孔雀石绿进行连续脱色，表明该菌具有良好的生产应用前景。白腐真菌在降解染料过程中易受到温度、pH、金属离子等多种环境因素的影响，需要进一步评估这些影响因素并优化其脱色工艺，以期推动生物脱色的理论创新和实际应用。
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