巩性涛，田宪玺，赵 莹，黄熙荣，王春霞，黄 伟，刘珊珊，李雅健，宋永泉，赵 皖，丁 丽，肖理文
（1.山东省粮油检测中心，济南 250101；
2.江苏省粮油质量监测中心，南京 210000；
3.山东省中储粮粮油质监中心有限公司，济南 250199；
4.南京微测生物科技有限公司，南京 210000；
5.上海飞测生物科技有限公司，上海 201400）
玉米赤霉烯酮（Zearalenone）又称F-2毒素，它首先从有赤霉病玉米中分离得到，1980年李季伦教授发现其它植物体内也存在玉米赤霉烯酮，如小麦、大豆等植物。玉米赤霉烯酮其产毒菌主要是镰刀菌属（Fμsariμm）菌株，如禾谷镰刀菌、三线镰刀菌、黄色菌孢、木贼菌孢、半裸菌孢及茄病镰孢等菌种[1-2]。
玉米赤霉烯酮主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物，新版食品安全标准中规定，粮食谷物及其制品中，小麦、小麦粉中玉米赤霉烯酮最高限量不得超过60 μg/kg，玉米、玉米面（渣、片）中玉米赤霉烯酮最高限量不得超过60 μg/kg[7-8]。其中玉米的阳性检出率为45%，最高含毒量可达2 909 mg/kg，小麦的阳性检出率为20%，含毒量为0.364~11.05 mg/kg。玉米赤霉烯酮的耐热性较强，110℃下处理1 h才能被完全破坏。
玉米赤霉烯酮具有雌性激素作用，能造成动物急慢性中毒，引起动物繁殖机能异常甚至死亡，会对畜牧业造成巨大经济损失。妊娠期的动物食用含有玉米赤霉烯酮的食物可引发流产、死胎和畸胎，食用含有赤霉病麦面粉制作的各种面食也可引起中枢神经系统的中毒症状，如恶心、发冷、头痛、神智抑郁和共济失调等。
目前，一般都采用液相和气相色谱的方法测定玉米赤霉烯酮，测定结果准确，但是测定的方法较为复杂，对仪器的要求高，且无法在现场和基层小型实验室使用[3]；
胶体金快速定量法检测粮食中玉米赤霉烯酮的含量，检测限为5 μg/kg[4]，根据颜色深浅和仪器内置曲线自动计算样品中玉米赤霉烯酮的含量，步骤简单，检测快速，但检测准确度与重复性较差，容易造成假阳性或假阴性；
因此针对快速检测试纸卡存在的不足，山东省粮油检测中心与南京微测生物科技有限公司基于荧光定量免疫层析平台的玉米赤霉烯酮荧光定量快速检测试纸卡进行了产品优化升级，使之操作简单快速，准确度和重复性较高，且整体使用成本较进口快检产品降低30%左右，能更好满足不同客户的日常检测需求，确保粮食和食品的安全。
1.1 试剂和材料
除注明外，均为分析纯，试验用水均为国标一级蒸馏水。
玉米赤霉烯酮荧光定量快速检测试纸卡由乳胶垫、NC膜、样品垫及吸收垫组成，乳胶垫上包裹有荧光微球标记玉米赤霉烯酮抗体；
NC膜上喷涂有玉米赤霉烯酮抗原检测线和羊抗兔二抗控制线。样品提取液、样品稀释液、标准曲线ID卡及标准曲线条形码均由上海飞测生物科技有限公司提供。
玉米赤霉烯酮的标准品：购自Sigma公司；
大米、玉米、小麦等样品从超市购得或从企业取样；
麸皮，小麦、面粉等饲料样品从饲料厂、面粉加工厂和小麦收储企业取样。
1.2 仪器与设备
FD-600型荧光免疫定量分析仪和FD-2000型试纸卡恒温孵育器，由上海飞测生物科技有限公司提供生产；
低速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；
漩涡混匀器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；
电子天平，Sartoriμs赛多利斯公司。
1.3 试验方法
1.3.1样品的前处理
取具有代表性的待测样品500 g，用粉碎机粉碎1 min后过20目筛，收集过筛后的均匀细小样品。称取过筛后的样品5.0±0.02 g于50 mL离心管中，加入25 mL提取液，用漩涡混匀器振荡3 min(或者摇床振荡3 min）后，4 000 r/min离心2 min，取上清液。
1.3.2检测过程
100 μL离心上清液加入400 μL样品稀释液中，用漩涡混匀器混匀3~5 s，然后取100 μL待测液加入到玉米赤霉烯酮荧光定量试纸卡的加样孔中，置于37℃恒温孵育器中孵育8 min，8 min后将试纸卡插入荧光定量免疫分析仪中读数，读数值即为样品的实际检测浓度。当检测值大于5 000 μg/kg时，可用提取液将离心上清液稀释5倍后再按照后续步骤进行检测，所得读数值乘以5即为样本最终的检测浓度。
1.3.3试纸卡原理
当将待测样品滴加在试纸卡加样区时，样品中的玉米赤霉烯酮与结合垫中荧光微球标记的玉米赤霉烯酮抗体结合并通过毛细作用向前层析，到达检测区后，检测线T线上固定的玉米赤霉烯酮抗原与剩余未结合的荧光微球标记玉米赤霉烯酮抗体结合。检测线T线上结合的荧光微球标记抗体的量与样品中待测物的量成反比，质控线C线结合的荧光标记物与样品中待测物的量无关，剩余或其它荧光标记物继续层析达到吸收区。反应结束后，使用荧光定量免疫分析仪读取T线和C线的荧光强度并计算T/C值，通过仪器内置的标准曲线即可计算出样品中玉米赤霉烯酮的含量。
1.3.4试纸卡优化
在单T线的基础上，增加一条矫正T线，形成一条质控线C线、两条检测线T线。
1.3.5稀释液优化在原有稀释液缓冲体系离子浓度的基础上，增加缓冲体系离子浓度，拓宽对样品pH值调节范围。
2.1 玉米赤霉烯酮试纸卡检测线数量由两线优化成三线的实验结果
选用国标法测定玉米赤霉烯酮，在浓度值为空白的样本中分别添加浓度为10、25、50、100、250、500、1 000 μg/kg的玉米赤霉烯酮，然后按照玉米赤霉烯酮试纸卡检测方法同时进行两线及三线试纸卡检测，每个加标样本各检测2个平行样，对比试纸卡的灵敏度，检测结果见表1；
选取高中低3个加标浓度点，每个加标样本检测6个平行样，对比试纸卡的重复性，检测结果见表2。
从表1可知，玉米赤霉烯酮三线试纸卡的25μg/kg检测灵敏度为32.52%；
两线试纸卡的25μg/kg检测灵敏度为26.53%；
从单一25 μg/kg浓度点检测灵敏度对比，三线试纸卡灵敏度更高；
且综合对比不同浓度点的检测灵敏度，也得出玉米赤霉烯酮三线试纸卡灵敏度较两线试纸卡更高。
表1 玉米赤霉烯酮两线与三线试纸卡的灵敏度 （浓度单位：μg/kg）
从表2可知，筛选高中低三个浓度点进行重复性检测，玉米赤霉烯酮三线试纸卡检测变异系数CV范围为6.10%~8.72%；
两线试纸卡检测变异系数CV范围为8.27%~11.08%；
对比三线试纸卡与两线试纸卡的检测变异系数CV范围，三线试纸卡检测变异系数CV更小，重复性更高。
表2 玉米赤霉烯酮两线与三线试纸卡的重复性 （浓度单位：μg/kg）
综合对比玉米赤霉烯酮三线试纸卡与两线试纸卡的灵敏度与重复性，玉米赤霉烯酮三线试纸卡比两线试纸卡灵敏度、重复性更高。
2.2 玉米赤霉烯酮试纸卡稀释液缓冲体系从50 mM改为100 mM的实验结果
选用玉米加工副产物中pH值为中性的样本上清液，分别调节样品上清液的pH值为2、4、6、8、10、12，然后按照玉米赤霉烯酮试纸卡检测方法同时进行50 mM及100 mM离子浓度样品稀释液的检测，每个pH值样品上清液各检测2个平行样，对比试纸卡的准确度，检测结果见表3。
从表3可知，50 mM离子浓度样品稀释液检测回收率范围99.82%~155.52%，100 mM离子浓度样品稀释液检测样品回收率范围97.43%~112.05%，尤其在样品上清液为酸性条件下，100 mM离子浓度样品稀释液检测结果更稳定，所以增加缓冲体系离子浓度，可以拓宽对样品pH值的检测范围。
表3 相同样本不同pH上清液检测结果
2.3 选用检测线数量为三线、100 mM离子浓度样品
稀释液玉米赤霉烯酮试纸卡进行产品性能检测
2.3.1玉米赤霉烯酮试纸卡的检出限及定量限的实验结果
选用国标法测定玉米赤霉烯酮，取浓度值为空白样本20份，按照玉米赤霉烯酮试纸卡检测方法进行检测，每个样本检测1个试纸卡。结果见表4。
由表4中检测数据分析可知：玉米赤霉烯酮试纸卡检出限为5.097 μg/kg；
定量限为14.291 μg/kg。
表4 玉米赤霉烯酮试纸卡的检出限及定量限 （浓度单位：μg/kg）
2.3.2玉米赤霉烯酮试纸卡检测范围的实验结果
选用国标法测定玉米赤霉烯酮，在浓度值为空白的样本中分别添加浓度为25、50、100、250、500、1 000 μg/kg的玉米赤霉烯酮，然后按照玉米赤霉烯酮试纸卡检测方法进行检测，每个加标样本各检测2个平行样。检测结果见表5。
通过表5的检测数据可知，在空白样本中添加玉米赤霉烯酮的浓度为25 μg/kg时，检测灵敏度为33.08%，与空白样本检测存在梯度差；
阴性样本加标浓度从25~1 000 μg/kg时，检测灵敏度范围为33.08%~96.22%，且不同浓度点检测抑制率分散率较好，故玉米赤霉烯酮可定量检测范围为25~1 000 μg/kg。
表5 玉米赤霉烯酮试纸卡的检测范围 （浓度单位：μg/kg）
2.3.3玉米赤霉烯酮试纸卡的准确度和重复性的实
验结果
选用国标法测定玉米赤霉烯酮，在浓度值为空白的玉米、小麦样本中分别添加浓度为25、50、100、250、500、1 000 μg/kg的玉米赤霉烯酮，然后按照玉米赤霉烯酮荧光定量试纸卡的检测方法进行检测，每个加标样本各检测5个平行样。检测结果见表6。以添加的标准品浓度为横坐标，玉米赤霉烯酮荧光定量试纸卡的检测结果为纵坐标，拟合曲线并计算线性相关系数，结果如图1、图2所示。
通过表6可知，小麦样本的加标回收率为91.67%~116.51%；
玉米样本的加标回收率为93.01%~115.67%；
综合两种不同基质样本加标检测回收率范围为91.67%~116.51%，说明样本加标检测回收率高，玉米赤霉烯酮试纸卡检测准确度较高；
小麦样本的变异系数CV范围为3.42%~10.63%；
玉米样本的重变异系数CV范围为2.15%~8.32%；
综合两种不同基质样本加标检测变异系数CV范围为2.15%~10.63%，说明玉米赤霉烯酮试纸卡整体变异系数CV较小，试纸卡重复性较好。
表6 玉米赤霉烯酮试纸卡的准确度和重复性
如图1、图2可知，计算得出小麦的线性范围25~1 000 μg/kg(6点），回 归 方 程：y=0.9172x+13.872，相关系数R2=0.9981；
玉米的线性范围：25~1 000 μg/kg(6点），回归方程：y=0.999x+10.792，相关系数R2=0.995。
图1 小麦中玉米赤霉烯酮毒素添加与玉米赤霉烯酮试纸卡的线性关系
图2 玉米中玉米赤霉烯酮毒素添加与玉米赤霉烯酮试纸卡的线性关系
2.3.4玉米赤霉烯酮试纸卡的稳定性的实验结果
将玉米赤霉烯酮检测试纸卡放在2~10℃环境下保存，并在每个月固定日期进行样本检测，筛选固定浓度玉米赤霉烯酮标准品用于试纸卡稳定性检测，每个样本检测1个试纸卡，检测结果见表7。
通过表7数据可知，玉米赤霉烯酮试纸卡在2~10℃保存12个月，不同基质样本的检测偏差范围为-9.62%~9.04%，说明玉米赤霉烯酮试纸卡在2~10℃温度12个月的保存整体偏差在10%以内，说明产品稳定性较好。
表7 玉米赤霉烯酮试纸卡的稳定性 （浓度单位：μg/kg）
2.4 设备与产品优化后进行玉米粉中玉米赤霉烯酮不同单位验证检测
通过表8~表16的计算分析可知，三家验证单位检测结果平均值也符合国家标准适用性要求，说明设备与产品稳定性较好。
表8 检出限与定量限（单位：μg/kg）：玉米基质
表16 仪器稳定性结果（单位：μg/kg）：玉米基质
验证单位1：山东省粮油检测中心；
验证单位2：中储粮山东分公司质检中心实验室；
验证单位3：江苏省粮油质量监测中心。
表9 浓度水平1准确性结果（单位：μg/kg）：玉米基质
2.5 优化试纸卡与其它产品检测对比
通过表17中优化产品同国外知名品牌产品对同一样本检测数据对比，优化产品回收率为99.67%，国外知名品牌产品回收率为90.72%；
优化产品变异系数CV为3.68%，国外知名品牌产品回收率为11.04%，从样本值检测回收率与变异系数CV数据分析，优化产品的检测效果优于进口产品，说明可以替代进口产品。
表17 优化产品与进口产品玉米赤霉烯酮质控品检测结果 （单位：μg/kg）：玉米基质
表10 浓度水平2准确性结果（单位：μg/kg）：玉米基质
表11 浓度水平3准确性结果（单位：μg/kg）：玉米基质
表12 浓度水平1台间差结果（单位：μg/kg）：玉米基质
表13 浓度水平2台间差结果（单位：μg/kg）：玉米基质
表14 浓度水平3台间差结果（单位：μg/kg）：玉米基质
从玉米赤霉烯酮荧光定量试纸卡三线与两线的灵敏度、不同浓度点梯度与重复性等的检测数据对比可知，三线试纸卡灵敏度更高；
不同浓度点分布更合理，且三线试纸卡检测变异系数CV范围更小，重复性更高；
从增加样品稀释液中缓冲体系的离子浓度对不同pH值样本上清液检测数据影响对比可知，缓冲体系离子浓度增加时，检测结果符合度更高，会明显降低不同pH值对样本检测结果的影响。且通过对选用高离子浓度缓冲体系样品稀释液的三线试纸卡其检测限、检测范围、不同基质样本重复、稳定性等检测验证实验可知，优化后三线试纸卡的准确度、重复性、稳定性等均达到更优的效果，更能满足快速定量检测需求。另外根据荧光定量免疫分析仪稳定性要求检测鉴定结果可知，仪器稳定性好且两台设备的测定结果之间不存在显著性差异，完全可以替代同类进口仪器。
表15 浓度水平2重复性结果 （单位：μg/kg）：玉米基质
从产品性能上综合评价，普通免疫层析快检产品通常采用单检测线（T线）定量方法，产品研发周期更短，生产工艺更为简单，成本也更低，但检测结果的精密度难以控制，导致结果的重复性较差。玉米赤霉烯酮荧光定量快速检测试纸卡在单T线的基础上，增加一条矫正T线，与质控线（C线）一起，形成“双保险”，大大提升了检测结果的准确度、精密度和重复性。通过对产品样品稀释液的优化，进一步降低了样品pH值对最终产品检测的干扰，进一步提升了样本检测的准确度，为构建国家粮食安全体系提供有力的技术支撑。
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