冷佳蔚，石 峰，杭宝建，薛维丽，张乃斌，巩丽萍
（山东省食品药品检验研究院 国家药品监督管理局仿制药研究与评价重点实验室 山东省仿制药一致性评价工程技术研究中心，山东 济南 250101）
盐酸法舒地尔是一种蛋白激酶抑制剂即细胞内钙离子拮抗剂，分子结构为5-异喹啉磺酰胺衍生物，能改善脑组织微循环，促进神经再生[1]。该药由日本旭化成公司首先研发，1995年6月首次在日本上市。我国于2001年批准日本旭化成公司进口盐酸法舒地尔注射液，商品名为“依立卢”[2-4]。
盐酸法舒地尔是以5-异喹啉磺酸为原料、N, N-二甲基甲酰胺为催化剂，与二氯亚砜反应，经过碱化与高哌嗪取代反应及减压浓缩，再通过精制制得[5-7]。在反应过程中生成的5-异喹啉磺酰氯盐酸盐会有残存部分不能与高哌嗪充分反应，残留在反应混合物中，重结晶精制过程中残留的5-异喹啉磺酰
氯盐酸盐可能与重结晶溶剂中的甲醇或乙醇反应，生成5-异喹啉磺酸甲酯或5-异喹啉磺酸乙酯。这两个化合物均为基因毒性杂质，超过一定含量时会诱导DNA损失，发生基因突变，对人体产生极大的危害[8]，因此有必要控制此类杂质的含量。
目前报道的盐酸法舒地尔杂质的测定方法有液相色谱、液质联用法等[9-12]。基因毒性杂质一般为痕量残留，灵敏度高的质谱检测法更能满足检测要求。本研究采用超高效液相色谱-串联质谱建立了盐酸法舒地尔中5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的检测方法，相比于高分辨质谱检测方法适用范围广，洗脱方式为等度洗脱，操作简单，方法简便、快速、准确、灵敏，可用于盐酸法舒地尔的质量控制。
1.1 仪器
AB SCIEX Triple Quad 6500+超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（美国AB公司）；
XSE205电子天平（瑞士Metter Toledo公司）；
KQ-300GDV型恒温数控超声器（昆山市超声仪器有限公司）；
Vortex-6涡旋振荡器 （海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。
1.2 试药
5-异喹啉磺酸甲酯对照品（广州佳途科技股份有限公司，批号：A2-12-12，纯度：98.9 %），5-异喹啉磺酸乙酯对照品（广州佳途科技股份有限公司，批号：C4X-13656-1808，纯度：99.5 %）。甲醇（色谱纯），甲酸（质谱级），水为超纯水。
样品：盐酸法舒地尔原料药共7批（批号：1706001，1706002，1706003，1807001，1807002，1807003，Y1807001）。
2.1 色谱与质谱条件
液相色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 µm），流动相为0.1 %甲酸水溶液-0.1 %甲酸甲醇溶液（60:40），流速0.3 ml/min，柱温40 ℃，进样量1 μl。
质谱条件：电喷雾离子源（ESI）正离子扫描模式，多反应监测（MRM）；
离子源温度：550 ℃。定性、定量离子对、锥孔电压、碰撞能量见表1。
表1 质谱参数
2.2 溶液的制备
对照品溶液：取5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯各约10 mg，精密称定，加甲醇定量稀释制成含5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯均为5 ng/ml的溶液。
供试品溶液：取盐酸法舒地尔样品约12.5 mg，精密称定，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。
2.3 专属性
精密量取空白溶剂（甲醇）、对照品溶液、供试品溶液各1 µl，分别注入液质联用仪，记录色谱图。空白溶剂与供试品溶液中其他杂质峰均不干扰5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯的检测，表明该方法的专属性良好，见图1。
图1 空白溶剂（A）、供试品溶液（B）和对照品溶液（C）的MRM色谱图
2.4 标准曲线和范围
精密称取5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯各约10 mg，置于同一量瓶中，加甲醇定量稀释成浓度分别为2，5，10，20，50，100，200 ng/ml的系列溶液，作为标准曲线溶液，分别注入液质联用仪测定。以溶液浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线。5-异喹啉磺酸甲酯在2.05～205.32 ng/ml范围内，回归方程为Y=61 714X+58 160，相关系数（r）为0.9997，5-异喹啉磺酸乙酯在1.90～190.24 ng/ml范围内，回归方程为Y=86 787X+74 012，r为0.9998，均表明线性关系良好。
2.5 检出限与定量限
取对照品溶液逐级稀释，注入液质联用仪，记录色谱图，以信噪比3:1计算检出限，2种杂质的检出限分别为0.51，0.48 ng/ml，以信噪比10:1计算定量限，2种杂质的定量限分别为2.05，1.90 ng/ml。
2.6 精密度
取对照品溶液注入液质联用仪，连续进样6针，记录色谱图，2种杂质的保留时间的RSD值分别为0.66 %，0.48 %，峰面积的RSD值分别为2.05 %，1.59 %。另精密量取定量限溶液注入液质联用仪，连续进样6针，2种杂质峰面积的RSD值分别为1.30 %，3.00 %，表明该方法精密度良好。
2.7 重复性
由于样品中未检出5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯，通过向供试品中加入5 ng/ml的5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯，得到的加标供试品溶液作为重复性试验供试品溶液，同法制备6份，分别注入液质联用仪，计算2种杂质测定结果的RSD值分别为1.69 %，1.62 %，表明该方法重复性良好。
2.8 稳定性考察
取对照品溶液，分别在0，2，4，6，20 h注入液质联用仪，记录色谱图，计算2种杂质峰面积的RSD值分别为4.32 %，2.73 %，表明2种杂质的稳定性好。
2.9 回收率
本方法通过向阴性样品中分别添加100 %浓度水平的硫酸二甲酯对照品溶液，平行进行6次试验，按外标法计算5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯的含量，以测得量与加入量的比值计算回收率，结果见表2。5-异喹啉磺酸甲酯的回收率为102.84 %～105.68 %，RSD值为1.24 %；
5-异喹啉磺酸乙酯的回收率为103.27 %～107.11 %，RSD值为1.57 %，表明该方法的回收率和精密度良好，满足实际样品的检测需求。
表2 5-异喹啉磺酸甲酯与5-异喹啉磺酸乙酯的加标回收率（n=6）
2.10 杂质限度规定
5-异喹啉磺酸甲酯、5-异喹啉磺酸乙酯是盐酸法舒地尔在重结晶精制过程中产生的磺酸酯类化合物，具有遗传毒性，对人体危害较大。根据ICHM7基因毒性杂质评估和控制的相关指导原则[13]及欧盟（EMA）对基因毒性杂质限度指南规定[8]，人在长期服药时基因毒性杂质每天摄入量不能超过1.5 μg，盐酸法舒地尔用法用量中规定每天最大服用量为90 mg，因此，可将5-异喹啉磺酸甲酯和5-异喹啉磺酸乙酯的限度规定设为不得过0.0017 %。
2.11 样品测定
将7批盐酸法舒地尔原料药按2.2项下方法制备供试品溶液，注入液质联用仪进行测定，记录色谱图和峰面积。按外标法分别以224.1→129.0（m/z）离子峰面积计算5-异喹啉磺酸甲酯的含量，以238.0→210.0（m/z）离子峰面积计算5-异喹啉磺酸乙酯的含量，7批样品中均未检出上述2种杂质，表明盐酸法舒地尔原料生产工艺中2种磺酸酯类基因毒杂质控制良好。
本文建立了超高效液相色谱-串联质谱测定盐酸法舒地尔中2种磺酸酯类基因毒杂质含量的检测方法，进行了方法学验证并将方法用于实际样品的测定。本方法采用常规三重四级杆液质联用仪测定，通用性好，洗脱方式为等度洗脱，专属性强、线性范围宽、回收率高，操作简便，样品前处理简单，结果可靠，重现性好，可用于盐酸法舒地尔中2种磺酸酯类基因毒杂质的测定。本研究有助于药品生产企业对生产工艺中基因毒杂质的控制，同时为药品监管提供技术支撑。
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