摘要 采用茶园调查和室内接种相结合的方法，研究了茶云纹叶枯病病菌(Colletotrichum carnelliae)侵入与不同叶位的关系。结果表明：自然状态下，病害症状主要出现在成、老叶上。2006年嫩叶组、成叶组和老叶组3处理的病叶率分别为0.89％、18.89％、10.67％，2007年分别为2.00％、19.56％、13.78％，其中嫩叶、成叶上的病害都是当年病菌侵染所致。茶枝离体接种时，症状出现在嫩叶和成叶上，而且以前者为多，2006年3处理的病叶率分别为15.28％、9.73％和O％，2007年分别为12.50％、8.73％和2.78％。结果显示：分生孢子的侵染叶位以嫩叶为主，在各类叶片上均有较高的萌发率，但只有部分能够形成附着胞，在嫩叶和成叶上形成率较高，老叶上几乎不能形成。不同叶位的解剖结构如角质层厚薄、栅栏组织层次多少、海绵组织细胞排列松紧等都与病菌侵染有一定的相关性。
关键词 茶云纹叶枯病；分生孢子；附着胞；发病率；病情指数
中图分类号 S435.711
茶云纹叶枯病是茶树上最常见的叶部病害之一，分布很广，一些主要产茶国如日本、印度、斯里兰卡等均有报道，国内各产茶省(自治区)均有发生。田间症状主要出现在成叶和老叶部位，病部出现灰白相间的云纹状病斑，病健分界较明显。成、老叶上的病斑很大，可扩展至叶片总面积的3/4，严重时会出现大量的落叶。近些年来，合肥周边茶区该病的发生有逐年加重的趋势，对茶叶生产的影响也越来越大，必须引起高度重视。本试验立足于探索茶树不同叶位与病叶率的关系和病原菌的侵染过程，旨在为病害的综合治理，特别是选择最佳防治时期提供理论依据。
1 材料和方法
1．1 茶园病情调查
2006年和2007年连续两年对该病在自然状态下茶树不同叶位的发病情况进行了随机抽样调查。设嫩叶组(1芽1叶～1芽3叶)、成叶组和老叶组3个处理，每处理3次重复。每重复调查150片叶，即1个处理调查450片叶。采用平行线取样法。记载病叶数和病级，并计算病叶率和病情指数。病斑分级按高旭晖分级法。
1．2 室内接种处理
两年的室内接种均在5月中旬进行。Collecto-trichurn cameliae菌种来自本校实验茶园，用PDA培养基分离培养，并配制成孢子悬浮液，浓度为3.49×106个/mL。配制插枝营养液(成分略)。在茶园剪取33 cm的健壮无病的枝条(福鼎)，每广口瓶插4枝，每3瓶为1重复，每处理重复3次。用喉头喷雾器在室内接种，保湿24 h后，在室温下培养。接菌后的温度白天均在22℃以上，夜晚在18℃以上，定时喷雾保湿，晴天保持不少于5 h的光照。除湿度较高外，其他基本上接近自然状态下的气候条件。同样设嫩叶组、成叶组和老叶组3个处理，对枝条上所有叶片都均匀接种，7 d后检查各处理的发病情况，嫩叶组和成叶组检查72片叶，老叶组检查36片叶(老叶在枝条上少)，并统计病叶率。
1．3 接种后病原菌动态观察
选取各处理的叶片共27片，每个处理9片，分别放在9个垫有双层滤纸的培养皿中，滤纸中浸有无菌水，3片/皿，每处理3皿，叶片经无菌水冲洗后放入培养皿。以上述浓度的孢子悬浮液接种，放入22。C下恒温培养。接种后48 h，在各处理中取1片叶，切取4 mm×3 mm的小块病组织，以苯胺蓝乳酚液作浮载剂，检查各处理叶片上平均每视野内的孢子数(取9个视野内的平均数)，逐日显微镜下检查孢子萌发情况，计算孢子的萌发率和附着胞的形成率，并注意菌丝的侵入过程。
1．4 接种后叶片的结构剖析
接种后7 d检查发病情况，记载各处理的病叶率，显微镜检各处理叶片叶背茸毛、气孔密度。每叶在叶尖或叶缘、中部和后部切取3块叶组织(3 mm×2 mm)，各处理检查9片叶，切下的叶块在卡诺氏液中过夜固定后，再放在滴有乳酸苯酚苯胺蓝的玻片上，处理后的叶组织置于显微镜下计数，取27个视野的平均值，并切片检查其角质层的厚薄、栅栏组织的层次、海绵组织细胞排列的松紧等等，看这些结构因子与病情之间有无内在的联系。
2 结果与分析
2．1 茶園病情调查
连续两年茶园病情调查结果见表1。
表中的数据可以看出：茶云纹叶枯病在茶园冠层层面上发病率很低，嫩叶组的病叶率分别为0.89％、2.00％，而在当年生的成叶上的病叶率和病情指数最高，在头年生的老叶上也出现了较高的病叶率和病情指数，这些老叶病斑上的子实体往往就是当年病害的初侵染源，在一定程度上影响着当年的病情。以LSR法对病叶率进行多重比较，各处理间均达到了极显著水平。成叶和嫩叶间达极显著水平，说明当年分生孢子侵入并引起发病的主要在成叶上；成叶和老叶间达极显著水平，说明当年罹病成叶脱落较多，老叶上的病斑仅作为翌年病害发生的初侵染源。从两年的调查结果来看，在合肥地区，2007年茶云纹叶枯病略重于2006年，虽然两年均属于中度偏轻发生年份，但从老叶组积累的病叶来看，病原菌有逐年增多的趋势，应引起足够的重视。
2．2 室内接种试验
插枝接种试验结果如表2。
表2数据显示，室内接种病情与茶园自然状态下的病情有较大的区别，前者在嫩叶组处理发病率最高，两年分别为15％和12％；成叶组次之，不到10％；老叶组很少发病。病叶率经LSR法多重比较，嫩叶组和成叶组间达极显著水平，说明嫩叶是分生孢子最易侵染的叶位，其次才是成叶；成叶与老叶间、嫩叶与老叶间的差异也分别达极显著水平，该病菌的分生孢子不能侵染老叶。病菌侵染叶片一是要靠孢子萌发时对叶片形成的机械压力，二是要靠孢子在侵染过程中分泌一些酶的作用，如角质分解酶、纤维素分解酶等，在机械压力和酶的共同作用下，孢子才能成功地侵染茶树。老叶的角质层和栅栏组织已完全形成，病菌很难突破其阻力来实现侵染。即不同叶位的结构因子的差异可引起病叶率的不同，除此之外，还可能与不同叶位细胞内的生化成分有关。
2．3 病原菌侵染的动态观察
分生孢子接种到叶片上其萌发动态如表3。
病原菌分生孢子在人工接种条件下，叶片表面的密度相当高，经显微镜检平均每个视野的孢子都在10个以上，而这些孢子经人工保湿和22℃的恒温培养，其萌发率也只维持在60％～80％之间，并不是每一个孢子都能萌发；而能形成附着胞的很少，其在嫩叶组和成叶组分别为23.08％和27.27％。真正能够成功地实现侵染，致使叶片形成病斑的就更少了，所以，病叶率要远低于孢子的萌发率和附着胞的形成率(表2、表3)。附着胞形成率经LSR法多重比较，成叶和嫩叶间差异不显著，说明分生孢子在成叶和嫩叶上均能较好的萌发和形成附着胞；成
叶与老叶间、嫩叶与老叶间的差异均达到极显著水平。据试验观察，落于嫩叶和成叶上的部分分生孢子，很快萌发，并形成附着胞，侵入细胞组织内，以菌丝穿行于细胞间。特别是在嫩叶组织问、菌丝分支速度较快，接种后5 d，密布呈网状；菌丝在成叶组织细胞间较稀疏，伸展速度也相对较慢。所以，离体茶枝接种时，嫩叶上的病叶率远高于成叶上，差异达极显著水平，这可能与两类叶片内部的抗性物质浓度有关；孢子在老叶的表面虽然可以萌发，但很少能形成附着胞，几乎不能实现侵染，除了与老叶的结构抗性有关外，还可能与叶表分泌物的种类和浓度有关。
2．4 叶片结构与病叶率间的关系
不同生态位叶片在结构上有所区别，它们对病菌实现侵染都具有一定的影响，最后导致病叶率的差异，结果见表4。
叶片解剖结果显示：病叶率与角质层厚薄，栅栏组织层次多少，海绵组织细胞排列松紧的关系较密切，特别是与角质层的厚薄、栅栏组织层次多少直接相关。室内接种试验表明，茶云纹叶枯病分生孢子在嫩叶上的侵染率远高于在成叶上。这可能与嫩叶上角质层较薄、栅栏组织没有完全形成等结构因子有关。当然，与嫩叶中某些营养成分和抗性物质的种类及浓度也有一定的关系，如游离氨基酸和多酚物质的相对含量等。需要指出的是，下部老叶的发病率很低，5月中旬调查老叶上的病斑基本上都是上一年遗留下来的病叶。
3 讨论
3．1 症状出现的叶位
室内人工接种显示，分生孢子在嫩叶和成叶上均能萌发，形成附着胞，以菌丝侵入到叶片组织细胞间，直至症状出现，而且，在嫩叶上更容易实现侵染。这与茶园内出现的情况很不一致。在自然状态下，茶云纹叶枯病症状主要出现在成叶上。落在嫩叶叶表的分生孢子从萌发到有明显症状(灰白色小斑)出现往往需要15 d左右，而此时的嫩叶亦已变为成叶了。嫩叶的定期采摘使得一些侵入的病菌还处在潜育期就被摘下了，未来得及表现症状。实验室内接种能基本满足分生孢子理想的侵入条件，而剪下的茶枝又停止生长，抗病性也相对降低，且叶片上一出现褐点状的病斑就被發现，一般仅需7 d左右，所以，症状出现在嫩叶上多。当然，离体茶枝成叶上出现的症状是接种在成叶叶片上的分生孢子侵入所致，与嫩叶无关。
3．2 老叶上的症状
经多年的观察，茶园中老叶上出现的病斑，病级较高，一般都在3～4级，这些病叶在深秋和严冬季节大多脱落，只有少数可以越冬，而成为翌年发病的初侵染源。2007年在室内离体接种的插枝上发现1片病叶，这可能是在剪枝时没有注意，从茶园带入的，不是在实验室侵染所致。经初步试验观察，分生孢子在老叶上虽然能较好地萌发，但不能形成附着胞，所以，不能侵染老叶，茶园中老叶上的病斑一般都是由成叶上病斑遗留下来的。
3．3 综合治理
根据试验结果和病原菌的生物学特性，结合当前的无公害茶叶生产考虑，对于该病的防治应采用控制病原菌为主的措施。最好在深秋除去茶树老叶中的病叶，并清理茶园中的落叶，旨在控制越冬菌源。春季的定期采摘对控制该病的流行具有明显的作用。病害特别严重的茶园可在深秋封园时，在采用上述措施的基础上，每隔2～3年喷1次石硫合剂或波尔多液。