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[摘要] 目的 分析温州地区幽门螺杆菌（Hp）对克拉霉素和左氧氟沙星的耐药情况及相关耐药基因突变特征，同时检测患者的药物代谢酶CYP2C19的代谢类型。通过综合分析药物代谢酶和耐药位点突变情况为临床Hp个体化治疗提供理论依据。 方法 选择2015年1～3月在瑞安市人民医院经胃镜和病理检查确诊的慢性胃炎患者116例，其中男67例，女49例，年龄24～76岁，平均（43.8±5.3）岁。采用E-test法测定Hp对克拉霉素和左氧氟沙星的最低抑菌浓度（MIC），耐药判定标准：克拉霉素MIC>1 μg/mL，左氧氟沙星MIC>1 μg/mL。提取Hp基因组DNA，采用PCR法扩增23S rRNA和gyrA基因片段，并对扩增产物进行测序。个体CYP2C19代谢类型的测定同样采用PCR扩增和测序的方法。 结果 34株克拉霉素耐药Hp菌株的23S rRNA V区均有基因突变发生，突变位点A2143G最为常见，突变率达到91.17%。左氧氟沙星耐药Hp菌株的gyrA基因最常见的突变方式为N87K（56.76%）。个体药物代谢酶类型主要为快代谢和中代谢类型。 结论 23S rRNA基因的突变位点A2143G是导致Hp对克拉霉素耐药的主要原因。gyrA基因的87和91位氨基酸突变是导致Hp对左氧氟沙星耐药的主要原因。临床Hp根除治疗应适时采用高通量检测技术提高个体化用药效能。
[关键词] 幽门螺杆菌；耐药；测序；CYP2C19
[中图分类号] R978.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）08（b）-0020-05
[Abstract] Objective To investigate drug resistance of Helicobacter pylori （Hp） strains to levofloxacin and clarithromycin in Wenzhou district， and to detect the type of CYP metabolism， so as to provide theoretical basis for clinical anti-Hp treatment. Methods 116 patients with chronic gastritis were selected in Rui′an People"s Hospital from January 2015 to March 2015 and their diagnosis under gastroscope and pathology were analyzed. The patients included 67 cases of male， 50 cases of female， aged from 24 to 76 years old， average （43.8±5.3） years old. Minimum inhibitory concentration （MIC） values for clarithromycin and levofloxacin resistance in Hp were tested by E-test method. Genomic DNA of Hp was extracted， followed by PCR amplification and DNA sequencing for 23S rRNA and gyrA fragments. Determination of CYP2C19 metabolism type was also performed by the methods of PCR amplification and sequencing. Results 34 Clarithromycin resistant Hp strains showed mutations in the 23S rRNA V region， most commonly seen at Site A2143G （91.17%）. Gene gyrA of the levofloxacin-resistant strains was mostly mutated as N87K （56.76%）. The types of individual drug metabolizing enzymes were mainly fast metabolism and medium metabolism. Conclusion A2143 mutation of 23S rRNA leads to the Hp resistance to clarithromycin. The 87 and 91 amino acid mutations of gyrA gene are the main reasons for the Hp strains resistance to levofloxacin. The eradication therapy of Hp infection should be based on the high throughput detection technology to improve the effectiveness of individual drug use.
[Key words] Helicobacter pylori； Drug resistance； Sequencing； CYP2C19
抗生素滥用与幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）耐药在我国是普遍存在且非常严重的问题。遏制Hp耐药发展、保证抗菌药物的疗效已经到了刻不容缓的时刻。目前，影响Hp感染个体化根除治疗疗效的因素主要包括三方面：宿主、Hp和抗生素。宿主主要包括CYP2C19的基因多态性会明显影响质子泵抑制剂（proton pump inhibitors，PPI）代谢水平及抑酸效果，对Hp根除疗效产生影响[1]；Hp因素主要为Hp对抗生素的耐药性，其中又以三联疗法中克拉霉素和左氧氟沙星的耐药为主[2]；抗生素因素主要包括抗生素的药物剂量、服用频率、疗程等因素的影响。本文采用药敏实验E-test法和PCR产物测序法对Hp临床分离株进行了克拉霉素和左氧氟沙星的耐药检测并同时检测了患者CYP2C19的代谢类型，通过二者联合检测指导临床Hp根除治疗过程中的合理用药。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2015年1～3月在瑞安市人民医院经胃镜和病理检查确诊的慢性胃炎患者116例，其中男67例，女49例，年龄24～76岁，平均（43.8±5.3）岁。所有患者1个月内均未服用任何抗Hp治疗药物。胃窦黏膜标本经快速尿素酶实验证实Hp阳性。胃窦黏膜组织立即放入1 mL的脑心浸出液（BHI）液体培养基（杭州致远医学检验所有限公司）中，-80℃保存备用。本研究方案通过医院伦理委员会审核，纳入研究前所有患者均签署知情同意书。根据药物靶点分析得知，常见几种用于根除Hp感染的抗生素，其作用靶蛋白所富集开发的药物多为以下疾病治疗药物，排除此类病例入组就减少了药物副作用发生的可能[3]。排除标准：心血管疾病患者、哮喘患者、糖尿病患者、神经系统疾病患者、近期服用其他药物患者。
1.2 方法
1.2.1 药敏实验 分离培养Hp菌株，采用E-test法测定Hp对克拉霉素和左氧氟沙星的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。耐药判定标准：克拉霉素MIC>1 μg/mL，左氧氟沙星MIC>1 μg/mL。
1.2.2 PCR扩增及耐药位点测序 采用细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）按照说明书步骤提取Hp基因组DNA。分别扩增Hp克拉霉素耐药基因23S rRNA、左氧氟沙星耐药基因gyrA。扩增引物由杭州致远医学检验所有限公司合成，详细见表1。PCR反应体系50 μL：DNA模板5 μL，500 nmol/L上下游引物，1U rTag酶，200 μmol/L dNTP，1×PCR buffer，ddH2O 29 μL。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s、52℃退火30 s、72℃延伸30 s循环35次，72℃延伸5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生化科技有限公司），对PCR产物切胶回收纯化后，送军事医学科学院采用Illumina HiSeq2000测序仪测序。结果与Hp标准菌株26695序列进行比对。见表1。
1.2.3 药物代谢酶CYP2C19 PCR扩增及测序 PCR引物CYP2C19*2位点扩增的正向引物：AATTACAACCAGAGCTTGGC；反向引物：TATCACTTTC CATAA AAGCAAG；CYP2C19*3位点扩增的正向引物：TAT TATTATCTGTTAACTAATATGA；反向引物：ACTTCAGGG CTTGGTCAATA。经PCR扩增，得到目标片段长度：CYP2C19*2为166 bp，CYP2C19*3为327 bp。PCR产物进行切胶回收纯化后，送军事医学科学院测序。
1.3 确定基因型
测序结果与人类基因库中的CYP2C19*2、CYP2C19*3基因序列比对，确定待测突变位点上的基因型。
2 结果
2.1 HP药敏检测实验
本次研究共成功分离出107例Hp菌株，其中13例对克拉霉素耐药，16例对左氧氟沙星耐药，21例对克拉霉素和左氧氟沙星双重耐药，剩余57例为敏感菌株。具体突变特征见表2。
2.2 Hp耐药基因突变特征分析株
从测序结果可以看出，34株克拉霉素耐药Hp菌株的23S rRNA V区均有突变发生，突变位点A2143G较常见[4]，突变率达91.17%， 其他依次为A2174G（5.88%）、A2187G（2.95%）。37例Hp临床分离株经PCR均扩增出gyrA基因中含喹诺酮类耐药决定区的目的片段。测序结果显示，37株左氧氟沙星耐药Hp菌株的gyrA基因突变方式主要为N87K（56.76%）[5]，其他依次为N87I（16.22%）、D91N（21.62%）和D91G（5.40%）。57例敏感菌株中未发现突变位点。
2.3 药物代谢酶CYP2C19测序分析
根据CYP2C19的遗传多态性可把其分为两种表型，即强代谢型和弱代谢型[6]。其中强代谢型根据基因型的不同又可被分为纯合子强代谢型和杂合子强代谢型即中间代谢型。通过对107例样CYP2C19*2和CYP2C19*3位点进行测序，部分测序图谱见图1，测序结果分析如下：
2.3.1 CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型在测序样本中的分布 在107例样本中，21例为野生型纯合子，占比19.63%。55例只有一种基因发生杂合突变（*1/*2、*1/*3），为中间代谢型。其中*1/*2型45例，*1/*3型10例。一种基因发生纯合突变或两种基因均发生杂合突变者31例，为慢代谢人群，其中*2/*2型9例，*2/*3型21例，*3/*3型1例。见表3。
2.3.2 CYP2C19*2和CYP2C19*3基因突变情况的分析 在107个样本中，发生于681位点的突变（GA和AA）较常见（n=75，70.09%）。其中以杂合突变居多（n=66，61.68%）。纯合突变9例，占比8.41%。636位点杂合突变31例，占比28.97%；发生在636位点的纯合突变概率较低（n=1），占比0.93%。
3 讨论
目前临床用于Hp根除治疗的抗生素主要有甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星、阿莫西林、庆大霉素、呋喃唑酮[7]。PPI主要包括奥美拉唑、兰索拉唑、雷贝拉唑、埃索美拉唑[8]。
在Hp根除的三联疗法中，由于患者个体间药物代谢酶代谢能力的差异，导致个体对PPI的治疗效果差异较大。在浙江地区，Hp对抗生素的耐药主要集中在甲硝唑、克拉霉素和左氧氟沙星三种药物上[9]。甲硝唑的耐药率达90%以上，已不适合作为临床根除Hp治疗药物。浙江地区Hp根除治疗过程中主要考虑为克拉霉素和左氧氟沙星耐药。
有研究表明，克拉霉素耐药的主要原因是由于23S rRNA基因突变导致[10]。23S rRNA基因最常见突变位点主要包括A2142和A2143位点[11]。在本研究中，A2142位点并未发生突变，主要突变位点为A2143位点，说明浙江地区克拉霉素耐药主要是由于A2143位点突变导致。左氧氟沙星耐药主要是由于gyrA基因突变导致，突变主要发生在第87和91位氨基酸[12]。37株左氧氟沙星耐药Hp菌株的gyrA基因突变最常见的突变方式为N87K（56.76%），其他依次为N87I（16.22%）、D91N（21.62%）和D91G（5.40%）。
对107例样本的药物代谢酶CYP2C19进行测序分析发现强代谢和中等代谢型共占比近70%， 慢代谢型占30.99%。提示大部分人群服用正常剂量PPI后，由于药物代谢较快，体内血药浓度维持时间不长，根除治疗达不到理想效果。对于强代谢型患者，要增加PPI给药剂量而不是增加抗生素给药剂量，在一定时间内保持PPI体内的血药浓度以提高Hp的根除率[13]。抗菌药物的作用机制为直接杀灭Hp，PPI通过增加胃内PH值，通过多种机制改善抗生素的抗菌疗效，延长抗菌药物半衰期并提高稳定性，具有特异性抗Hp作用，和抗生素具有协同作用[14]。PPIs中只有雷贝拉唑通过肝内的非酶途径代谢，即通过与葡萄醛酸结合和形成硫醚醛酸后由尿排泄，与绝大多数药物无药动学相互作用，仅影响少数依赖胃酸吸收的药物，故在临床上更为安全、稳定[15-28]。对于浙江地区的PPI使用，应该首先考虑雷贝拉唑的使用或者对经CYP2C19代谢的PPI药物临床使用要适当增加剂量以确保抑酸效果。
综上所述，临床Hp个体化根除治疗适时应采用高通量测序技术检测Hp对抗生素的耐药性并同时检测个体药物代谢酶CYP2C19的代谢类型，根据Hp菌株对抗生素的耐药情况和个体CYP2C19的代谢类型合理选用抗生素和PPI以提高临床Hp根除疗效。
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（收稿日期：2016-04-20 本文编辑：赵鲁枫）