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中图分类号 R943;R917文献标志码 A文章编号 1001-0408（2019）20-2876-05
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.20.27
摘 要 目的：综述串联质谱法在合成多肽药物结构表征方面的应用进展，为该类药物的结构表征提供方法参考。方法：以“合成多肽药物”“多肽测序”“串联质谱”“质谱法”“结构确证”“Synthetic polypeptide drugs”“Peptide sequencing”“Tandem mass spectrometry”“Mass spectrometry”“Structure interpretation study”等为关键词，组合查询了2000年1月-2019年1月中国知网、万方、维普、Springer Link、Web of Science、PubMed等数据库中的相关文献，对串联质谱法应用于确证合成多肽类药物结构的研究进展进行归纳与总结。结果与结论：共检索到相关文献192篇，其中有效文献52篇。合成多肽药物主要由氨基酸构成，这类药物在结构确证研究方面与一般药物有所不同。根据目前相关技术指导原则以及有关文献研究，合成多肽药物结构表征的主要内容包括分子量测定、氨基酸组成和序列分析、二硫键分析以及二级结构分析等。近年来，串联质谱法及其与其他方法的结合在合成多肽药物结构确证中应用广泛，成为Edman降解多肽测序法的有效补充，且其因灵敏度高、分析速度快、所需样品量少等优点，已成为确证多肽药物结构的有力工具。
关键词 合成多肽药物;串联质谱法;Edman降解;结构确证
多肽药物是介于大分子蛋白/抗体类药物和小分子药物之间的一类重要的药物分子，因其生物活性高、靶向专一性高、选择性高、毒副作用低等优点而被广泛应用于疾病治疗领域[1]。近年来，微球、脂质体、聚乙二醇（PEG）修饰等方法的深入应用解决了多肽药物稳定性差、体内易降解、半衰期短等成药性差的问题，促进了多肽药物的开发利用[2-4]。多项临床前实验和临床研究表明，多肽药物药效广泛，可用于治疗骨质疏松症、糖尿病、前列腺疾病、子宫内膜异位症、肢端肥大、溃疡和甲状腺功能减退等多种疾病[5-7]，未来的商业价值和发展前景巨大[8-9]。到目前为止，美国FDA已批准了90多种活性多肽药物进入市场[6，10-11]，其中许多获批的多肽是通过化学方法合成的，包括液相合成或固相合成的方法，还有更多的合成多肽药物正处在上市前的研究中[12]。随着合成多肽药物研发数量的不断增长，对这类药物结构确证方面的研究也在不断开展。目前常用的肽和蛋白质N端测序方法为Edman降解法，但其存在结果不明确、灵敏度低等缺点。例如，色氨酸和半胱氨酸等氨基酸残基因受到背景干扰可能无法检测到，因此Edman降解法难以对微量肽、N-端封闭肽或多肽混合物进行表征。随着测序技术和仪器的发展，串联质谱法已成为一种高效、高灵敏和高通量的肽类测序工具，在合成多肽药物分子结构确证方面发挥了重要作用。笔者以“合成多肽药物”“多肽测序”“串联质谱”“質谱法”“结构确证”“Synthetic polypeptide drugs”“Peptide sequencing”“Tandem mass spectrometry”“Mass spectrometry”“Structure interpretation study”等为关键词，组合查询了2000年1月-2019年1月中国知网、万方、维普、Springer Link、Web of Science、PubMed等数据库中的相关文献。结果，共检索到相关文献192篇，其中有效文献52篇。现对串联质谱法在确证合成多肽药物结构中的相关应用研究进行综述，以期为该类药物的研发提供参考。
1 合成多肽药物结构确证相关技术指导原则及研究内容
1.1 相关技术指导原则
合成多肽药物本质上属于化学药物的范畴，国家食品药品监督管理局（SFDA）于2004年发布的《化学药物原料药制备和结构确证研究技术指导原则》[13]将多肽药物归于化学药物之中，并对其结构确证的测试方案进行了简要说明。但是合成多肽药物因其结构的特殊性，在制备方法、结构确证、质量研究等方面有其特殊要求，对此美国FDA早在1994年就发布了有关多肽药物的指导原则“Guidance for Industry for the Submission of Chemistry，Manufacturing，and Controls Information for Synthetic Peptide Substances”[14]，但该指导原则于2006年被美国FDA官方撤回。我国SFDA在2007年发布了《合成多肽药物药学研究技术指导原则》[15]，该项指导原则的提出对合成多肽药物结构表征、质量控制等方面的相关研究起到了规范作用。但到目前为止，国内的相关指导原则也未进行相应更新，所以仍缺乏有关合成多肽药物结构确证的官方指南。在国内外现有的相关指导原则以及有关文献研究的基础之上，科学合理地对合成多肽药物结构进行准确表征，对这类药物的研发有着重要意义。
1.2 合成多肽药物结构确证研究内容
一般化学原料药结构确证研究的主要内容包括平面结构、立体结构、晶型及结晶水/结晶溶剂等方面[13]，而合成多肽药物分子则更需要在氨基酸组成分析、氨基酸序列分析、二硫键分析等方面进行结构确证研究。
1.2.1 分子量测定 同化学原料药一样，合成多肽药物的结构确证中也包括分子量的测定，一般采用质谱法进行单同位素质量的测定，其质量偏差应在理论值的±1.0 个质量单位内;对于分子量在2 kDa以上的多肽，使用高分辨质谱仪更为合适[16]。
1.2.2 氨基酸组成分析 氨基酸组成分析可说明多肽的组成是否正确，不仅能证明多肽的结构，还能在一定程度上反映样品的纯度（是否含有合成杂质）。在进行氨基酸组成分析时，要注意考察所涉及的各类氨基酸，尤其是非天然氨基酸和氨基酸衍生物的色谱行为，以准确进行定性、定量分析。此外，在该项分析当中应建立合适的水解方法，因为不同的水解条件可能会对某些氨基酸的回收产生较大影响[17]，如pH<3时，谷氨酰胺（Gln）会经酸催化脱氨而发生水解;而在pH>7时，Gln不易形成六元环，更加稳定。