[摘要]运用UPLC-Q-TOF/MS技术研究人参与附子配伍对大鼠血清中内源性标记物的影响，旨在发现人参对附子减毒作用的内源性标记物及其分子机制。连续7 d给予健康雄性Wistar大鼠不同配伍的参附水煎液20 g·kg-1，收集血清，通过主成分分析和偏最小二乘判别法分析参附配伍对内源性代谢物的影响。参附合并组中，谷胱甘肽、磷脂酰胆碱、柠檬酸含量下降，同时抗坏血酸、尿酸、D-半乳糖、色氨酸、L-苯丙氨酸的含量上升。说明参附合煎液中附子对心脏产生了毒性影响。参附合煎组中与空白组对比表现出了类似或者稍弱的趋势，但是大部分并不具有统计学意义。对比参附合煎组与合并组，可以得出参附配伍减毒的科学性。结果可见，人参与附子配伍可以减轻附子的心脏毒性， 柠檬酸、谷胱甘肽、磷脂酰胆碱、尿酸可作为附子造成心脏毒性的潜在标记物。
[关键词]人参;附子;增效减毒;内源性标示物;代谢组学
Cardiotoxicity study of Shenfu compatibility in rats based on metabonomics
HE Jia-le1，2， ZHAO Jia-wei1，2， MA Zeng-chun2*， LIANG Qian-de2， WANG Yu-guang2，
TAN Hong-ling2， XIAO Cheng-rong2， TANG Xiang-lin2， GAO Yue2*
（1.Graduate School of Anhui Medical University， Hefei 230032， China;
2.Institute of Radiation Medicine Sciences， Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100850， China）
[Abstract]To research the effect of Ginseng Radix et Rhizoma and Aconiti Lateralis Radix Praeparata compatibility on cardiac toxicity in rats by UPLC-Q-TOF/MS， and explore the endogenous markers and molecule mechanism. Different compatibility of Shenfu decoction were given to male Wistar rats at dosage of 20 g·kg-1 for 7 days， collected the serum， and analyze the endogenous metabolites effected by Shenfu formulation by principal component analysis and partial least-squares analysis. Results showed that content of glutathione， phosphatidylcholine and citric acid decreased in mixed-decoction group， while ascorbic acid， uric acid， D-galactose， tryptophan， L-phenylalanine increased. The results showed cardiac toxicity of Aconiti Lateralis Radix Praeparata in Shenfu mixed-decoction. Shenfu co-decoction group showed a similar or weaker trend compared with control group， but most of them do not have a statistically significant. The results indicated the scientific basis of Shenfu compatibility by comparison of co-decoction group with mixed-decoction group. Shenfu compatibility can reduce cardiac toxicity induced by Aconiti Lateralis Radix Praeparata， and citric acid， glutathione， phosphatidyl choline， uric acid might be regarded as potential markers of cardiotoxicity.
[Key words]Ginseng Radix et Rhizoma; Aconiti Lateralis Radix Praeparata; synergism and attenuation; endogenous makers; metabolomics
doi：10.4268/cjcmm20151412
代谢组学（metabonomics）是继基因组学、蛋白质组学、转录组学后出现的新兴“组学”。它是对某一生物或细胞在一特定生理时期内所有低相对分子质量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门新学科。以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以信息建模与系统整合为目标的系统生物学的一个分支<sup>[1]</sup>。目前国内外专家应用代谢组学技术研究中药主要集中在对药材品质的评价、中药饮片药效作用机制、中药炮制机制、中药复方配伍规律、中药复方药效作用机制、中药毒性作用机制等方面<sup>[2]</sup>。常用的分析方法有核磁共振（NMR）、色谱质谱联用等，包括液质联用（LC-MS，UPLC-Q-TOF/MS）、气质联用（GC-Q-TOF-MS/MS，GC-MS），电泳质谱联用（CE-MS）和等离子体质谱（ICP-MS）等联用技术。
参附方（Shenfu formulation，SFF）源于宋代严用和之《济生续方》，其人参、附子比例经过历代医家的研究，或为增效，或为减毒，逐渐变成今天常用的1∶1。人参，性温，味甘，微苦，附子，辛，甘，大热，有毒，有回阳救逆，益气固脱之功效，现代药理学研究以及临床实践证明其具有心血管保护作用<sup>[3]</sup>。但附子燥热峻猛毒烈，对心脏有很明显的毒性作用，是典型的既是有效成分也是有毒成分的代表，为了降低其毒性作用增加药理作用，配伍人参以制其毒，目前对于其配伍减毒进行了大量有价值的研究<sup>[4-6]</sup>，但是运用代谢组学这一方法对其复方成分对于整体作用的角度阐述该机制尚处于初步阶段。本实验在前期体内外配伍减毒物质基础的基础上<sup>[7]</sup>，以代谢组学理论为指导，运用UPLC-Q-TOF/MS （ultra performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight /mass spectrometer）技术分析参附方给药大鼠的血清代谢差异，寻找潜在的生物标记物，为参附配伍增效减毒提供科学的证据。
1材料
1.1动物雄性Wistar大鼠，体重180～220 g，6～8周龄，军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号SCXK（军） 2007-004。
1.2材料与试剂人参（吉林，批号20110901）、附子（四川江油，批号20120317），由军事医学科学院放射与辐射医学研究所马百平研究员鉴定人参为五加科多年生草本植物人参Panax ginseng C.A. Meyer.的干燥根，附子为毛茛科多年生草本植物乌头Aeonitum carmichaels Debx.的子根。甲酸（色谱纯，CNW Technologies GmbH公司），乙腈（色谱纯，Fisher Scientific公司），甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。
1.3仪器Acquity UPLC系统和Synapt Q-TOF/MS系统（Waters公司）;Acquity HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm， 1.8 μm，Waters公司）;MassLynx V4.1质谱工作站（Waters公司）;冷冻离心机（Heraeus Labofuge 400R）;TTL-DCⅡ型氮气吹干仪（余姚市长江温度仪表厂）;纯水仪（Millipore Simplicity）。
2方法
2.1供试药液的制备以及样品的采集与处理准确称取人参附子各200 g，按照药典的方法煎煮浓缩成为每毫升含1 g生药当量的人参水煎液、附子水煎液、参附合煎液、参附合并液，其中参附合煎液与合并液的区别在于，合煎液中人参与附子一起煎煮，而合并液中人参与附子分别单独煎煮然后合并成为合并液。
将50只雄性Wistar随机分成5组，分别标记为空白组、人参组、附子组、参附合煎组、参附合并组。常规饲养3 d后，按照20 g·kg-1的剂量分别连续7 d给予生理盐水、人参水煎液、附子水煎液、参附合煎液、参附合并液。在末次给药1 h后腹腔静脉取血，静置1 h析出血清，4 ℃下 3 000 r·min-1离心15 min，取上层血清-80 ℃保存。取200 μL血清加入800 μL甲醇沉淀蛋白，4 ℃下13 000 r·min-1离心15 min，取上清，N2吹干有机溶剂，200 μL流动相（50%乙腈）复溶，4 ℃保存待测。
2.2色谱与质谱条件色谱条件：采用Acquity HSS T3（2.1 mm×100 mm， 1.8 μm，Waters公司）色谱柱，进样量10 μL，流速0.45 mL·min-1，柱温45 ℃;流动相A：0.1%甲酸水溶液;流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液。正离子模式下梯度洗脱条件：0～2 min，5%B;2～6 min，5%～12%B;6～8 min，12%～20%B;8～16 min，20%～50%B;16～16.5 min，50%～100%B;16.5～17.5 min，100%B;17.5～18 min，100%～5%B，18～18.5 min，5%B;负离子模式下梯度洗脱条件：0～1 min，25%B，1～3 min，25%～30%B;3～16 min，30%～35%B;16～17 min，35%～25%B;17～18 min，25%B。
质谱条件：采用电喷雾电离离子源（ESI），离子源温度100 ℃，锥孔电压40 V，脱溶剂温450 ℃，脱溶剂气体流速900 L·h-1，锥孔气流量50 L·h-1，m/z 70～1 200。正负离子V模式下毛细管电压分别为2.9，3 kV，质量校正质核比m/z 分别为556.277 1，554.261 5。
2.3数据处理与分析质谱数据采用MassLynx 4.1软件进行预处理，包括峰提取、峰对齐及归一化。后期的数据处理采用模式识别技术，本实验采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判别分析（partial least squared discriminant analysis，OPLS-DA）进行数据分析。并通过实验室自建Exact Mass Search（EMS）质谱数据库以及MassLynx工作站对潜在的标志物进行标记，最后通过在线Human Metabolome Database（HMDB）数据库对获得的潜在标志物进行辨别。使用GraphPad Prism V5.0（GraphPad Software， USA）软件对处理后的数据进行One-Way ANOVA（置信区间95%）检验。
3结果
血清样品经过LC-MS分析之后，得到各组具有代表性的总离子流图（TIC）见图1。
将LC-MS数据进行PCA和PLS-DA分析。PCA作为一种无监督的模式识别方法，通过将分散在变量中的信息集中到主成分上来描述数据内部结构。得到的PCA得分图直观显示了不同组别下生物体代谢模式的变化，具有相同或者相似状态的样本处于相近的位置。而PLS-DA是一种有监督的模式识别方法，在分析X变量时考虑变量Y矩阵，筛选得到由组间差异而形成的潜在标记物，在显著提高分类判别能力的同时减少了干扰因素对相似性聚类分析的影响。结果显示，空白组、参附合煎组和参附合并组样本基本分离，而且各组样本点之间聚集良好，说明大鼠在灌胃给予参附合煎液、参附合并液之后体内内源性代谢物发生了较明显的改变，结果见图2。
变量重要性投影（variable importance projection，VIP）是用于评价潜在标记物的一个变量，通过偏最小二乘判别分析计算VIP，取VIP>1时，共发现187个生物标示物，通过HMDB数据库在线检索得到可能的标志物15个，以及在不同组别中相对含量的变化见表1。
对相对含量的数据进行进一步的One-Way ANOVA统计分析可以得到，参附合煎组与参附合并组之间具有统计学差异的标志物4个，这表明了参附合煎组与合并组对于大鼠内源性代谢物的影响，提示了附子造成心律失常之后的内源性标记物以及参附配伍减毒的科学内涵，见图3。
4讨论
附子的毒性很大，中毒反应主要表现在心脏毒性，临床上主要以心律失常为主。造成心脏毒性的主要毒效成分是乌头碱、中乌头碱、次乌头碱等双酯型生物碱，临床上常常使用配伍来减轻附子的毒性。目前对于参附配伍减毒体内外的药理学研究趋于明朗，但是对于毒性靶器官的认识依然处于初步的阶段。自从Nicholson首次利用核磁共振（NMR）技术发现其中大鼠尿液代谢物与肾损伤的关系之后，代谢组学技术逐渐成为了研究生物体病理生理状态和对外源性物质的生化效应的重要手段。本文通过代谢组学技术，试图探索药物与毒性靶器官之间的分子标示物，为参附方配伍减毒提供科学依据。
从发现的可能的分子标志物可以看出，包括了蛋白质代谢、糖类代谢、脂类代谢、三羧酸循环、核苷酸代谢以及生物体细胞内氧化还原反应等多种代谢反应途径的中间产物或者终产物。与空白组相比，参附合并组中，柠檬酸含量下降，同时D-半乳糖、色氨酸、L-苯丙氨酸的含量上升，有研究显示，当心血管系统受到损伤的时候，柠檬酸含量下降并且糖类和氨基酸水平升高<sup>[8]</sup>。尿酸是嘌呤的代谢最终产物，而嘌呤是核酸的氧化分解的代谢产物，是鸟类和爬行类的主要代谢产物，而正常人体尿液中产物主要为尿素，仅含少量尿酸。有研究显示当心肌缺血，心肌能量供应不足的时候，ATP降解产物次黄嘌呤、黄嘌呤增多，在代谢为最终产物尿酸的过程中，产生大量的ROS<sup>[9]</sup>。因此尿酸水平的增加，预示着ROS的大量产生以及心肌缺血的出现。有研究显示，心血管疾病进程中氧化应激损伤是一个很重要的机制，而抗氧化剂对此有抑制作用<sup>[10-11]</sup>。而在参附合并组中，谷胱甘肽含量降低，抗坏血酸的含量上升。谷胱甘肽（GSH）是真核细胞内的主要还原剂，细胞内氧自由基（ROS）的清除通常伴随着GSH的减少。抗坏血酸具有强反应活性，可以清除OH自由基，生成脱氢抗坏血酸，在经过还原酶催化（GSH供氢）转变为还原形。它们与体内的其他抗氧化性物质一直构成了生物体内小分子抗氧化体系，清除自由基对膜类脂质、蛋白质的损伤。谷胱甘肽、抗坏血酸等抗氧化剂在保护心肌细胞免受损伤方面发挥了重要的作用。因此可以将谷胱甘肽作为心血管疾病中的一个分子标示物。参附合并组中的附子生物碱有可能造成了大鼠心律失常，从而使嘌呤的代谢紊乱，使血清中能检测到尿酸的水平上升，抗氧化作用的增强，参附合煎组并没有出现类似的情况，提示参附合煎可以有效的降低附子生物碱的毒性。
从磷脂酰胆碱体内代谢途径可以看出，在健康的状态下，大鼠的磷脂酰胆碱处于正常水平，在病理状态下，磷脂酰胆碱的含量急剧减少。磷脂酰胆碱在磷脂酶A2的催化下转化成花生四烯酸，花生四烯酸经环前列腺素H2、加氧酶前列腺素G2进一步转化为血栓烷A2和血栓烷B2，造成血瘀及血栓等一系列心血管疾病<sup>[12]</sup>。而鸟氨酸、精氨酸、鞘氨醇、核糖、烟酰胺核糖核苷等分子的含量上升或者下降，则可能是通过生物体内其他信号通路或者代谢途径的调节来发挥作用。 它们在生物体内对于心血管保护作用的具体功能有待于进一步研究。
通过对比参附合煎组、参附合并组以及空白组之间内源性代谢物的差异，以及通过统计学分析，得到4个可能的心血管疾病的分子标示物，分别是柠檬酸、谷胱甘肽、磷脂酰胆碱、尿酸。其进一步的分子机制以及各种标示物之间是如何协同或者拮抗而发挥作用将是以后重点研究的方向。
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[责任编辑张宁宁]