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摘 要 通过化学分析和生物活性评价考察丹参药材的品质差异，探讨丹参抗血小板聚集生物活性的主要贡献成分。采用高效液相色谱（HPLC）技术建立丹参药材HPLC指纹图谱，以抗血小板聚集相对效价作为指标，评价不同产地不同批次丹参药材的品质差异，构建基于化学表征及生物效价测定的评价模式。结果表明，不同批次丹参药材的HPLC指纹图谱相似度很高（相似度0.930～0.998），而其抗血小板聚集相对效价相差10倍，提示化学指纹图谱难以反映丹参的活性和质量差异。通过化学指纹图谱与抗血小板聚集生物效价进行谱效相关分析，筛选出与生物活性相关系数大于0.5的6个色谱峰：二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA及2个未知化合物。对上述4种已知化合物单体进行活性验证发现，隐丹参酮的抗血小板聚集活性最强，而其它3种丹参酮类化合物几乎没有体外抗血小板聚集活性。进一步比较丹参中高含量成分丹酚酸B与低含量成分隐丹参酮的活性贡献，结果表明，两者的活性贡献基本相当，说明隐丹参酮是丹参中低含量高活性成分，对评价丹参质量具有重要贡献度。
关键词 丹参； 抗血小板聚集； 指纹图谱； 生物效价； 谱效相关； 质量评价
1 引 言
随着中药质量控制技术飞速发展，以化学标志物为核心的药品标准和质量检验检测技术体系已达到发达国家水平，但尚未建立科学、严谨、低成本并符合中医药整体观及中药特点的中药产品质量保障体系。因此，需要尽快构建具有中国特色的中药技术规则，建立一个以临床疗效为导向，基于多环节、多指标、定量化、综合性的中药材评价控制方法体系，对中药材品质进行评价与控制，以期保证中药安全性、有效性和质量稳定性[1]。中药指纹图谱能够体现多组分中药的化学表征，可以控制中药的整体质量[2，3]。然而其所体现的化学成分与药效的相关程度尚不明确。因此，单独利用指纹图谱评价中药质量的优劣还存在一定的局限性[4，5]。而将指纹图谱与药效进行相关性研究（谱效相关），不仅可以使指纹图谱与其药效相关联，而且还能找到与活性密切相关的指纹图谱峰，从而构建对中药质量控制更有针对性的药效指纹图谱[6～9]。
最近，美国FDA发布《植物药发展的工业指南（2015版）》，指出生物评价是中草药和植物药发展的一个重要方法[10]。生物评价（Biological assay， Bioassay），是指在特定的实验条件下，评价供试药物作用于生物体系（整体动物、离体组织、器官、微生物和细胞以及相关生物因子等）所表达出的特定生物效应的方法，可用于定性或定量评价供试药物的质量[11]， 具有关联功效的优势。将生物评价方法应用于谱效相关中，可以使谱效关系更准确可靠[12]。
丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.干燥根及根茎，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈之功效[13]。丹参及相关制剂广泛应用于临床，加强其质量管理水平具有重要意义[14]。目前，丹参的指纹图谱已用于丹参及相关制剂的品质评价[15～17]； 丹参及其主要成分，特别是隐丹参酮的抗血小板聚集活性也有报道[18，19]。然而，隐丹参酮、丹酚酸B等成分及丹参药材基于抗血小板聚集活性的相对效价未见报道，单体成分对丹参药材品质优劣的贡献度仍然未知，这些指标性成分与功能主治、药效的关联程度也不明确。因此，本研究在丹参化学指纹图谱和抗血小板聚集效价的基础上，经过谱效相关分析，探讨丹参抗血小板聚集生物活性的主要贡献成分； 通过计算活性贡献度的方法，揭示脂溶性成分与水溶性成分对丹参质量评价的贡献度，将更全面地反映其内在质量，以保证临床用药安全性和有效性。构建的基于化学指纹图谱和生物评价的综合品质评价方法， 可为丹参品质评价提供参考，也为中药炮制、药材优良品种选育、临床处方选择及制剂工艺优化提供了新的评价模式。
2 实验部分
2.1 丹参样品采集
本研究共采集10批次样品，产地包括：甘肃（S1）、河南1（S2）、河南2（S3）、河北1（S4）、山东（S5）、山西（S6）、河北2（S7）、陕西（S8）、河北3（S9）、四川（S10）。样品经肖小河研究员鉴定为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎。
2.2 仪器与试剂
AggRAM血小板聚集仪（美国Helena公司）； 1200高效液相色谱仪（美国 Agilent 公司）； Zorbax eclipse plus C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm， 3.5 μm， 美国Agilent公司）； 花生四烯酸（美国Helena Lab公司）； 阿司匹林（中国食品药品检定研究院）； 丹酚酸B、丹参素钠、丹参酮ⅡA、丹参酮I、二氢丹参酮 I、隐丹参酮（成都普瑞法生物科技有限公司），以上对照品纯度均大于98%。
2.3 实验动物
雄性SD大鼠（军事医学科学院实验动物中心），SPF级，体重240～260 g，动物许可证号：SCXK（军）20120004。
2.4 化学指纹图谱测定及分析
准确称取丹参药材粉末3.0 g，加入80%甲醇超声提取，提取液经微孔滤膜过滤，供HPLC分析。HPLC条件：进樣量5 μL，流速0.6 mL/min，检测波长为285 nm。流动相为0.1% H3PO4 （A）和乙腈（B），梯度洗脱：0～20 min，10%～28% B； 20～25 min，28%～48% B； 25～40 min，48%～60% B； 40～45 min，60%～10% B[15]。用《中国药典》中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版计算相似度。应用MetaboAnalyst 3.0软件进行分析。
2.5 药材生物效价测定
2.5.1 对照品溶液制备 准确称取阿司匹林10.0 mg，加0.5% DMSO溶液500 mL，超声溶解，制成0.02 mg/mL溶液， 并按剂间距1∶0.8稀释成各个浓度的对照品溶液。
2.5.2 供试品溶液制备 准确称取丹参药材粉末3.0g，加入80%甲醇提取，提取液浓缩得浸膏，称取适量浸膏，加0.5% DMSO溶液，超声溶解，制成丹参供试品母液，并按剂间距1∶0.8稀释得到不同浓度的供试品溶液。
2.5.3 血浆制备 将大鼠腹腔注射0.12 mol/L戊巴比妥钠（60 mg/kg）麻醉，以0.13 mol/L枸櫞酸钠1∶9抗凝，腹主动脉取血。100×g离心15 min，吸取上清液作为富血小板血浆（PRP），剩余部分以2000×g离心10 min，取上清液即为贫血小板血浆（PPP）。
2.5.4 血小板聚集率测定 取PRP175 μL加入测试杯，然后取50 μL PPP加入测试杯，37℃温育，加入25 μL花生四烯酸，记录血小板聚集曲线及空白血浆的最大聚集率。另取175 μL PRP加入测试杯，再加入供试品溶液50 μL，同法测定供试品的最大聚集率。
2.5.5 相对校价计算 抑制率（I，%）=（空白血浆的最大聚集率-供试品的最大聚集率）/空白血浆的最大聚集率。计算不同浓度的供试品与对照品（阿司匹林）的抑制率，参照《中国药典》[20]和《药品生物检定》[21]“质反应平行线法”进行相对效价计算。
2.6 谱效相关
用MetaboAnalyst 3.0软件系统进行Kendall分析[22]及SPSS软件进行Spearman分析。
3 结果与讨论
3.1 化学指纹图测定
10批次丹参药材指纹图谱见图1A，相似度结果见表1。结果表明，10批次丹参药材相似度在0.930～0.998之间，相似度非常高。然而，相似度是均等比较所有成分的综合相似程度，如丹酚酸B就是丹参中高含量成分，其对指纹图谱相似度影响最大，因此，通过指纹图谱不易发现各批次丹参药材之间的差异。本研究共选取17个共有峰，以峰面积进行热图分析，结果见图1B，不同批次丹参药材中除丹参酮类成分外化学成分变异不大。聚类结果（图1B）中，批次4药材单独聚为一类，其丹参酮类化学成分为主要差异成分。而不同批次的药材质量是否存在差异，尤其是针对活血功效时丹参的品质是否有差异，目前尚无明确定论，究其根本原因，是品质评价方法的缺失造成的。
3.2 药材生物效价测定
由相对效价计算结果（图2）可知，本方法可以很好地区分不同批次丹参药材的质量差异，10批次药材中，丹参抗血小板聚集的最高效价与最低效价相差10倍，提示化学指纹图谱难以反映丹参的活性和质量差异。
对10批次丹参药材的17个色谱峰面积与抗血小板聚集效价进行Kendall相关分析及spearman相关分析，结果见图3。其中12～17号峰与抗血小板聚集效价具有较高相关性，相关系数大于0.5； 而具有显著性相关的是12、13、15号峰，特别是13号峰，具有最大的相关系数。
3.3 单体化合物活性验证
根据相关分析结果，结合文献报道，推测活性相关系数较高的色谱峰的结构[23]。经过比对，12、13、14和16号色谱峰与对照品色谱峰保留时间一致，确定为二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA，而15和17号峰为未知化合物，见图4A和4B。另外，计算丹参指纹图谱峰的对称因子、理论塔板数、分离度、选择度，结果见表2，HPLC相关参数达到分离要求，确定色谱峰的分离效果良好，从而排除色谱峰中的其它杂质成分干扰。
对已鉴定的化合物进一步验证，结果见图4C。隐丹参酮的抗血小板聚集抑制率为100%，而其它3个单体化合物在此浓度下没有抑制作用。本研究中二氢丹参酮Ⅰ（12号峰）、隐丹参酮（13号峰）、丹参酮Ⅰ（14号峰）、丹参酮ⅡA（16号峰）都与抗血小板聚集的效价相关度较高，但验证结果证明只有隐丹参酮（13号峰）有很强的抗血小板聚集作用（图4C）； 因此，谱效相关的方法仍有一定缺陷，尽管应用本方法能够得出相关系数较高的成分，但不能排除多个成分之间伴随相关的情况。为了排除伴随相关/自相关的存在，应将可辨识得到的单体化合物进行活性效价测定的验证，也就是逐个地对化合物进行活性测定，以确定这些成分与效价之间是真实相关，还是伴随相关。本研究对4种与药效密切相关的成分进行了活性验证，发现只有1种成分与药效密切相关，为真实相关，其它3种成分是伴随相关。
另外，测定并计算了丹参药材中指标性成分的丹酚酸B和隐丹参酮的抗血小板聚集相对效价，测定方法同2.5节，结果见表2（相对效价）。结果表明，单体化合物相对效价之间存在一定的差异，隐丹参酮的相对效价为1628 U/mg，比丹酚酸B（37 U/mg）的相对效价高40倍，为阿司匹林的1.6倍。隐丹参酮为丹参中抗血小板聚集的药效物质，隐丹参酮抗血小板高活性功能的发现，为进一步开发抗血小板聚集的新药的前体化合物提供可能[24]。隐丹参酮具有高活性的例子还发生在抑制血管新生，调节肝窦内皮细胞功能上， 例如，隐丹参酮可以抑制体外血管生成，但丹参酮ⅡA却没有抑制作用[25，26]。
活性贡献度即为指纹图谱中活性成分的峰面积与此成分单体化合物的相对效价的乘积，由此可以出计算活性贡献度，并比较丹参中高含量成分丹酚酸B与低含量成分隐丹参酮的活性贡献，丹酚酸B和隐丹参酮的活性贡献度分别为97779和90472，结果表明，两者的活性贡献基本相当。因此，可以通过计算效应成分指数的办法[27，28]对中药药效成分进行活性校正， 以更好地综合评控中药质量。
4 结 论
本研究通过测定不同批次丹参药材的指纹图谱，并结合其抗血小板聚集效价进行相关分析，构建了基于化学指纹图谱和生物评价的综合品质评价方法。此模式可以将中药质量评价与药材的生物活性或临床功效结合，不仅为多成分、多靶点的中药品质评价方法提供了参考依据，还可为中药炮制、优良品种选育、制剂工艺优化及临床合理用药提供指导。
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