摘要：目的 观察芪龙头痛颗粒的镇痛作用，探讨其治疗偏头痛的作用机制。方法 昆明种小鼠随机分为空白组、正天丸组、布洛芬组及芪龙头痛颗粒高、中、低剂量组。灌胃3 d后，采用热板法和醋酸扭体法评估芪龙头痛颗粒的镇痛作用。SD大鼠随机分为空白组、正天丸组、模型组、曲普坦组及芪龙头痛颗粒高、中、低剂量组。连续灌胃7 d后，腹腔注射硝酸甘油（10 mg/kg），4 h后，下腔静脉采血检测血浆降钙素基因相关肽（CGRP）和β-内啡肽（β-EP）水平。然后经心脏灌流，获取含有三叉神经脊束核尾段（Sp5C）的脑组织，采用免疫组化方法检测Fos蛋白表达。结果 芪龙头痛颗粒可显著提高小鼠的痛阈值，减少醋酸扭体反应次数；显著下调模型大鼠血浆CGRP水平，上调血浆β-EP水平，抑制Sp5C的Fos蛋白表达。结论 芪龙头痛颗粒具有良好的镇痛作用，其治疗偏头痛的机制可能是通过调节神经递质或神经肽水平及抑制Fos通路的活化发挥作用。
关键词：芪龙头痛颗粒；偏头痛；镇痛；降钙素基因相关肽；β-内啡肽；动物模型
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）02-0063-04
偏头痛以反复发生、单侧搏动性头痛为特点，通常伴恶心、呕吐、畏光和畏声等表现，严重影响患者的生活质量[1-2]。其发病机制非常复杂，一般认为其发作与颈外动脉血管舒张及三叉神经血管痛觉传导通路的活化有关[3]。在这些通路上，降钙素基因相关肽（CGRP）和Fos蛋白是三叉神经血管活化的生物学标志[4-5]。一些学者发现，β-内啡肽（β-EP）通过调节交感递质的释放，可能在偏头痛的发生机制上起作用[6]。目前为止，化学药物治疗偏头痛的有效率小于50%，且不良反应较多[7]。芪龙头痛颗粒是一种治疗偏头痛的中药复方，临床疗效较好。为此，我们进行动物实验观察其镇痛作用，探讨其治疗偏头痛的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
昆明种小鼠（体质量23～27 g）和SD大鼠（体质量180～220 g），SPF级，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK-（军）2007-004。
1.2 药物
芪龙头痛颗粒由中国人民解放军总医院药剂科制备而成，由黄芪、白芍2份，当归、葛根、白蒺藜1.5份，川芎、菊花、地龙1.2份，炙甘草、乳香、没药、天麻1份组成。所有药材购自安国市昌达中药材饮片有限公司，符合2010版《中华人民共和国药典》（一部）标准；布洛芬片，中诺药业（石家庄）有限公司，批号165120812；硝酸甘油注射液，北京益民药业有限公司，批号20120808；正天丸，华润三九医药股份有限公司，批号1110012H；苯甲酸利扎曲普坦片，湖北华源世纪药业有限公司，批号20130201。
1.3 试剂
戊巴比妥钠（北京化学试剂公司，批号020402），多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司，分析纯，批号20120412），Triton X-100（Sigma），牛血清白蛋白（批号0219989825，免疫分析级，MP公司），兔抗c-fos多克隆抗体（Abcam公司，批号GR95032-2），山羊抗兔IgG（Abcam公司，批号GR20931-3），山羊血清（Gibco，美国），即用型SABC试剂盒、3，3’-二甲基联苯胺（DAB）显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），CGRP放免试剂盒（HY-10045）、β-EP放免试剂盒（HY-10164），北京华英生物技术研究所。
1.4 主要仪器
WD-Ⅱ型热板仪、HX-10555不锈钢恒温循环器（中国人民解放军军事医学科学院实验仪器厂），自主活动箱（ZIL-2，中国医学科学院药物研究所），立体定位仪（江湾Ⅱ型，中国人民解放军第二军医大学），电热恒温鼓风干燥箱（北京陆希科技有限公司），恒温震荡培养箱（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），光学显微镜（BX40F4，Olympus Optical有限公司）。
2 实验方法
2.1 热板实验
将雌鼠放在（55±0.5）℃热板上，即开始计时，待小鼠出现舔后足时停止计时，这段时间视为小鼠的痛阈值。剔除痛阈值>30 s或<5 s的小鼠，将被接受的72只小鼠随机分为空白组、正天丸（2.34 g/kg）组、布洛芬（26 mg/kg）组、芪龙头痛颗粒高剂量组（QLTT高剂量组，5.2 g/kg）、芪龙头痛颗粒中剂量组（QLTT中剂量组，2.6 g/kg）和芪龙头痛颗粒低剂量组（QLTT低剂量组，1.3 g/kg）。各组连续灌胃3 d，在末次灌胃后30、60、120、180 min分别检测小鼠的痛阈值。痛阈值超过60 s者记为60 s。
2.2 醋酸扭体实验
雌雄小鼠各半，分组与给药同上。末次灌胃1 h后，皮下注射1%醋酸溶液（10 mL/kg），记录小鼠发生扭体反应的潜伏期和15 min内的扭体次数（扭体反应表现为弓背、收腹、肢体伸展）。
2.3 偏头痛模型制造
将70只SD大鼠随机分为空白组、模型组、曲普坦组、正天丸（1.62 g/kg）组及QLTT高（3.6 g/kg）、中（1.8 g/kg）、低（0.9 g/kg）剂量组。曲普坦组大鼠经硝酸甘油（10 mg/kg）腹腔注射30 min后，给予苯甲酸利扎曲普坦（0.9 g/kg）灌胃；其余各组大鼠连续7 d预防性灌胃治疗，于末次灌胃1 h后腹腔注射硝酸甘油。4 h后，4 mL/kg 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，下腔静脉抽取血样本。然后根据Wu等[8]描述，用一根导管经左心室插入升主动脉，切除右心耳，经导管迅速推注20 mL 0.9%氯化钠溶液，再用300 mL 4%多聚甲醛先快后慢滴注固定组织，直到肢体与内脏僵硬。迅速断头，将其放置立体定位仪上，取出脑组织，切出三叉神经脊束核尾段（Sp5C，耳间线后4.4～5.6 mm），10%中性甲醛后固定24 h，脱水、蜡块包埋和切片。
2.4 血浆降钙素基因相关肽、β-内啡肽检测
下腔静脉取血2 mL，放入含30 µL 7.5%EDTA和40 µL抑肽酶的EP管中，4 ℃、3000 r/min离心10 min，取上清液存于-20 ℃冰箱待测。按照125I-CGRP与125I-β-EP放免试剂盒说明书检测。
2.5 Fos蛋白免疫组化检测
免疫组化按ABC法步骤进行。4 μm厚的切片先在62 ℃干燥箱中加热2 h，再经二甲苯和梯度酒精脱蜡与复水，然后在pH 6.0的枸橼酸钠溶液中于700 W微波炉中抗原修复，再用3%H2O2封闭10 min，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，之后，切片用10% 山羊血清37 ℃封闭2 h，再加兔抗c-fos抗体（1∶100）4 ℃孵育16 h。PBS冲洗3遍，用生物素化山羊抗兔IgG（1∶1000）37 ℃条件下孵育30 min，PBS再冲洗3遍，用ABC液37 ℃孵育20 min，PBS再冲洗4遍，用DAB显色液显色5 min。最后，切片、脱水、透明并封片。
用PBS代替一抗检验染色特异性，结果显示切片无阳性染色。大鼠的脊髓横断面染色做阳性对照，可见脊髓前、后角都充满核染色。每只大鼠制作6个组织切片，以5个不重叠的200倍显微视野切片的4个角与中心阳性细胞表达的总和作为该张切片的Fos阳性细胞数。由此计算出每只鼠的Fos阳性表达数，再计算出各组平均阳性表达数。
3 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。所有实验数据用—x±s表示。热板法实验数据用一般线性模型的重复测量方法分析，其余数据采用方差分析进行统计分析，方差齐性者用最小显著差数法（LSD）完成各组间比较，方差不齐，用Dunnett"s T3进行比较。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 芪龙头痛颗粒对小鼠痛阈值的影响
QLTT高、中剂量组均能显著提高小鼠给药后60～180 min的痛阈值，布洛芬组能提高给药后30～180 min的痛阈值，正天丸组能提高120～180 min内的痛阈值，结果见表1。
4.2 芪龙头痛颗粒对小鼠醋酸扭体反应的影响
与空白组比较，QLTT高、中、低剂量组均能显著减少小鼠扭体次数，但仅QLTT中剂量组能显著延长扭体潜伏期。正天丸组显著减少小鼠扭体次数，但不能延长扭体潜伏期；而布洛芬组能显著减少小鼠扭体次数和延长扭体潜伏期，差异均有统计学意义（P<0.01）。见表2。
4.3 芪龙头痛颗粒对血浆降钙素基因相关肽、β-内啡肽水平的影响
各治疗组均可降低硝酸甘油诱导的血浆CGRP水平，与模型组比较，除QLTT低剂量组外，其余各治疗组均可增加血浆β-EP含量。见表3。
4.4 芪龙头痛颗粒对大鼠Fos蛋白阳性表达的影响
对各组大鼠Fos蛋白阳性表达细胞进行计数，发现双侧Sp5C均有表达。各组动物Fos蛋白阳性表达的神经元数量不同，其中，QLTT中剂量组降低Fos蛋白表达最为明显。见图1、图2。
5 讨论
根据中医“不通则痛”理论，偏头痛的主要治疗原则是活血、祛瘀、通络和止痛，这也是芪龙头痛颗粒的主要功效。本实验对QLTT高、中、低3个剂量组进行研究，QLTT中剂量组的药物使用量相当于成人每日正常服用量（20 g）。正天丸是已上市中药，在临床广泛使用近30年，并已通过动物实验与临床观察证实有效，它与芪龙头痛颗粒在功能主治、制造工艺、给药途径上均相似，因此将其作为本实验的中药阳性对照药。根据不同的实验目的，我们分别选择布洛芬和苯甲酸利扎曲普坦作为镇痛和机制研究实验的西药阳性对照药。
头痛是偏头痛患者的主要临床表现，因此必须评估芪龙头痛颗粒的镇痛作用。热板法是一种反映小鼠对中枢和周围热刺激反应的常用方法，醋酸扭体反应是一种反映内脏痛的标准实验方法，它对各种镇痛药物的反应都很敏感[9]。这2个实验的结果显示芪龙头痛颗粒3个剂量组均有镇痛作用，以中剂量组镇痛作用最强，且在给药后120 min达到镇痛峰值。
CGRP是三叉神经血管活化的标志，在偏头痛发作期释放[3]。同时，一些研究表明偏头痛的发生与内源性阿片肽系统的损害密切相关，尤其是β-EP的异常可能导致痛觉传入调节紊乱[10]。偏头痛患者血浆β-EP水平显著降低，研究表明，内啡肽水平与头痛严重程度成负相关[11]。基于上述观点，我们通过检测血浆CGRP和β-EP水平来探讨芪龙头痛颗粒的作用机制。实验结果表明，芪龙头痛颗粒可显著下调偏头痛模型大鼠血浆CGRP水平，上调血浆β-EP水平。
三叉神经血管系统是偏头痛发生的解剖基础，它由起源于三叉神经节的无髓A-δ和C型神经纤维组成，将脑膜血管的痛觉信号经这些神经的周围突和中枢突传入Sp5C[12]。注射硝酸甘油可诱导Fos蛋白的表达，后者是Sp5C神经元活化的解剖标志[13]。然而，各治疗组均可显著减少硝酸甘油诱导的Fos蛋白表达，意味着这些药物可以缓解硝酸甘油诱发的疼痛感。
综上所述，芪龙头痛颗粒具有很好的镇痛作用，它可通过调节神经递质或神经肽水平及抑制Fos途径的活化来缓解偏头痛的发生。
参考文献：
[1] Cai DF. Current progress in the classification and treatment of headache[J]. Chin J Integr Med，2009，15（4）：243-247.
[2] Raggi A， Giovannetti AM， Quintas R， et al. A systematic review of the psychosocial difficulties relevant to patients with migraine[J]. J Headache Pain，2012，13（8）：595-606.
[3] Farinelli I， Missori S， Martelletti P. Proinflammatory mediators and migraine pathogenesis：moving towards CGRP as a target for a novel therapeutic class[J]. Expert Rev Neurother， 2008，8（9）：1347-1354.
[4] Arulmani U， Maassenvandenbrink A， Villalón CM， et al. Calcitonin gene-related peptide and its role in migraine pathophysiology[J]. Eur J Pharmacol，2004，500（1-3）：315-330.
[5] Han F， Zhang YF， Li YQ. Fos expression in tyrosine hydroxylase- containing neurons in rat brainstem after visceral noxious stimulation：an immunohistochemical study[J]. World J Gastroenterol， 2003，9（5）：1045-1050.
[6] Baldi E， Conti P， Conti R， et al. Hypernociceptive syndromes and pharmacological inhibition of endogenous opioid degradation[J]. Int J Clin Pharmacol Res，1986，6（3）：193-197.
[7] Nicolodi M， Galeotti N， Ghelardini C， et al. Central cholinergic challenging of migraine by testing second-generation anticholinesterase drugs[J]. Headache，2002，42（7）：596-602.
[8] Wu HQ， Guo HN， Wang HQ， et al. Protective effects and mechanism of puerarin on learning-memory disorder after global cerebral ischemia-reperfusion injury in rats[J]. Chin J Integr Med， 2009，15（1）：54-59.
[9] Wang YH， Liang S， Xu DS， et al. Effect and mechanism of senkyunolide I as an anti-migraine compound from Ligusticum chuanxiong[J]. J Pharm Pharmacol，2011，63（2）：261-266.
[10] Mosnaim AD， Diamond S， Wolf ME， et al. Endogenous opioid-like peptides in headache. An overview[J]. Headache，1989，29（6）：368- 372.
[11] Nappi G， Facchinetti F， Martignoni E， et al. Plasma and CSF endorphin levels in primary and symptomatic headaches[J]. Headache，1985，25（3）：141-144.
[12] Mitsikosta DD， Sanchez del Rio M. Receptor systems mediating c-fos expression within trigeminal nucleus caudalis in animal models of migraine[J]. Brain Res Rev，2001，35（1）：20-35.
[13] Bates EA， Nikai T， Brennan KC， et al. Sumatriptan alleviates nitroglycerin-induced mechanical and thermal allodynia in mice[J]. Cephalalgia，2010，30（2）：170-178.
（收稿日期：2013-09-11，编辑：华强）