摘要：目的 观察健脾养血祛风方对脾虚慢性湿疹模型小鼠皮损处水通道蛋白3（AQP3）含量的影响，并探讨其可能的作用机制。方法 取健康雄性小鼠50只，随机分为正常组、模型组、阳性药组及中药高、低剂量组。采用小剂量反复DNCB涂抹及番泻叶致脾虚证建立小鼠脾虚慢性湿疹模型。中药组予健脾养血祛风方灌胃，阳性药组予盐酸左西替利嗪灌胃。免疫组化法检测病变皮肤组织中AQP3的表达，同时观察皮肤组织病理变化。结果 病理观察结果显示，健脾养血祛风方对小鼠皮损处炎症损伤具有一定的修复作用。与正常组比较，模型组AQP3过度表达；与模型组比较，各给药组AQP3表达均明显下降，染色强度降低。模型组AQP3平均光密度值明显高于正常组（P<0.01）；与模型组比较，各给药组均能下调AQP3表达（P<0.05）。结论 健脾养血祛风方下调皮损中过度表达的AQP3可能是其治疗脾虚慢性湿疹的作用机制之一。
关键词：健脾养血祛风方；脾虚；慢性湿疹；水通道蛋白3；小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.014
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）07-0047-04
Effects of Jianpi Yangxue Qufeng Formula on Aquaporin-3 in Model Mice Skin Tissue with Chronic Eczema TIAN Jing1，2， LI Xin-hong2， ZHU Hui-wen1，2， MA Xian-de1， FENG Chang-qing2， WANG Min2 （1.Liaoning University of TCM， Shenyang 110032， China；2.Affiliated Hospital of Liaoning University of TCM， Shenyang 110032， China）
Abstract：Objective To observe the effects of Jianpi Yangxue Qufeng Formula （JPYXQF） on the AQP3 in mice with chronic eczema， and explore mechanism of action. Methods Fifty healthy male mice were randomly divided into 5 groups， namely normal group， model group， positive medicine group and JPYXQF high and low dose groups. Low-dose DNCB and Sennae Fominm were used to establish mice models of chronic eczema with spleen deficiency. JPYXQF groups were treated by JPYXQF for gavage， while the positive medicine group was treated by levocetirizine hydrochloride for gavage. The expression of AQP3 in mice skin tissue was detected by immunohistochemical method. At the same time， the pathological changes of skin were observed. Results The pathology of mice skin lesion showed that JPYXQF has certain recovery effects on the inflammation injury of skin lesion. Compared with the normal group， expression of AQP3 over expressed in model group. Compared with the model group， the expression of AQP3 in all treatment groups significantly decreased， and the staining intensity decreased. In the model group， the average optical density of AQP3 was significantly higher than that in the normal group （P<0.01）. Compared with the model group， the treatment groups can reduce the expression of AQP3 in mice skin tissues （P<0.05）. Conclusion JPYXQF can reduce the over expression of AQP3 in skin lesion， which is probably its mechanism for the treatment of chronic eczema.
Key word：Jianpi Yangxue Qufeng Formula；spleen deficiency；chronic eczema；AQP3；mice
基金项目：辽宁省教育厅高等学校科学研究项目（L2012342）；辽宁省中医药学（专）科能力建设项目（2011-lnzyxzk-03）
慢性湿疹常由急性或亚急性湿疹反复发作转化而来，也可起病即为慢性。临床常表现为皮肤增厚、苔藓样变，黯红或紫褐色，伴色素沉着或减退、抓痕、血痂，阵发性瘙痒。中医认为，脾主运化水湿，脾虚则湿浊内生，脾虚与慢性湿疹的发生、发展关系密切。慢性湿疹病程较久，久病必伤及脾，脾虚湿郁，生化乏源，复感风湿热邪，致血虚、生风生燥，继而出现皮肤肥厚，瘙痒顽固难愈[1]。Elias等[2]提出皮肤屏障功能破坏可能是湿疹的致病因素。水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）是一组与水通透有关的细胞膜转运蛋白，对维持人体内水平衡有重要的意义，是维持体内水液代谢平衡的分子学基础。其中与皮肤相关的水通道蛋白主要是AQP3，其具有皮肤水合、屏障功能及创伤愈合的作用。
本研究选取AQP3作为研究指标，采用脾虚慢性湿疹小鼠模型为研究对象，探讨以健脾养血祛风为原则的中药组方对脾虚慢性湿疹的作用机制，为临床治疗方案的选择提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物
昆明种SPF级健康小鼠50只，雄性，6～8周龄，体质量18～22 g，辽宁中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK（辽）2003-0016。分笼饲养，自然光照，自由饮水进食。实验设计及实施过程中严格遵循动物实验的3R原则[3]。
1.2 药物
健脾养血祛风方（党参15 g，白术15 g，山药20 g，生地黄20 g，当归20 g，制何首乌20 g，鸡血藤20 g，防风25 g，蒺藜10 g，白鲜皮20 g，甘草15 g）饮片购自辽宁中医药大学附属医院，传统方法煎煮浓缩，制成煎剂；番泻叶，饮片购自辽宁中医药大学附属医院。盐酸左西替利嗪片，重庆华邦制药有限公司，批号20130105，5 mg/片，用蒸馏水溶解制成混浊液。
1.3 主要试剂与仪器
2，4-二硝基氯苯（DNCB），解放军军事医学科学院药材供应站；丙酮，国药集团化学试剂（沈阳）公司，DNCB用丙酮配制成7%和0.1%的浓度备用；SP法免疫组化检测试剂盒，北京博奥森生物科技有限公司提供。电子天平（上海精密科学仪器有限公司）， WS2-261-79型电热恒温水浴箱（北京长安科学仪器厂），550酶标仪（美国Bio-Rad公司），石蜡包埋机（EG1150型，德国徕卡公司）。
1.4 造模
小剂量反复DNCB涂抹建立慢性湿疹模型[4-6]。将除正常组外40只小鼠腹部去毛（面积约2 cm×2 cm），实验当日，7%DNCB 25 μL涂于小鼠腹部剪毛区致敏，第2日强化1次，第5日背部剪毛（面积约2 cm×2 cm）， 第6日开始在鼠右耳双面及背部剪毛区各涂抹0.1%DNCB 5、15 μL激发，每隔3 d 1次，共4次。观察造模组小鼠的行为状态，出现皮肤明显增厚、粗糙、干燥，黯红斑及褐色结痂，有少量毛发生长，小鼠回头舔舐频繁，烦躁不安明显，即为造模成功。
参考文献[7]建立番泻叶致脾虚证小鼠模型。小鼠慢性湿疹模型造模第12日起加入脾虚造模程序。予小鼠灌服100%番泻叶煎剂0.5 mL/只，每日1次，连续7 d。观察造模组小鼠的行为状态，是否出现精神倦怠、懒动、嗜卧、拱背、扎堆、眼眯、毛色枯黄甚至稀少、耳尾色白、软便、便溏、泄泻、体质量增加减慢或体质量下降、体温（肛温）略有降低、食量减少等脾虚症状。出现5个以上症状即可认为脾虚模型复制成功。
1.5 分组及给药
采用随机数字表法，将实验小鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组及中药高、低剂量组，每组10只。末次激发24 h后给药。小鼠给药剂量根据人与小鼠体表面积比例进行换算，中药高剂量组（含原药材1.33 g）、中药低剂量组（含原药材0.33 g）、阳性药组（含盐酸左西替利嗪0.03 mg）0.4 mL/只灌胃。正常组及模型组予等量生理盐水灌胃。连续14 d。
1.6 取材
末次给药后24 h，称重，脱颈处死，取小鼠耳部正常及病变皮肤组织块。
1.7 形态学观察
取小鼠耳部皮肤组织，用10%甲醛溶液固定以做病理组织学检查，HE染色，镜下观察各组耳部病变组织炎症细胞浸润情况。
1.8 水通道蛋白3表达检测
免疫组化法对耳部皮肤组织AQP3表达水平进行检测，应用Leica Q550CW图像采集和分析系统，测定单位面积阳性细胞的平均光密度值作为其表达情况。
1.9 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 小鼠耳部皮肤组织病理观察结果
正常组小鼠表皮无角化过度、增厚及海绵形成，真皮层无炎细胞浸润，无血管扩张。模型组小鼠表皮角化过度，棘层肥厚，细胞间水肿不明显，无表皮内水疱，真皮血管周围炎性浸润明显。中药高剂量组小鼠表皮角化过度不明显，棘层肥厚明显减轻，真皮内炎性浸润显著减少，内皮细胞肿胀减轻。中药低剂量组小鼠表皮角化过度及棘层肥厚，真皮内炎性浸润减少，内皮细胞肿胀减轻。阳性药组与中药高剂量组结构变化基本相似。各组小鼠耳部皮肤组织病理形态见图1。
2.2 健脾养血祛风方对小鼠耳部皮肤组织水通道蛋白3的影响
各组表皮细胞的细胞浆中均有不同程度的AQP3表达（浅褐色至棕褐色），正常组织中呈弱阳性表达，模型组平均光密度值明显高于正常组（P<0.01）；与正常组比较，模型组AQP3表达明显增强，棕褐色颗粒染色明显加深；与模型组比较，各给药组平均光密度值低于模型组（P<0.05），AQP3表达水平明显下降，阳性产物减少。结果见图2、表1。
正常组 模型组 阳性药组 中药高剂量组 中药低剂量组
图1 各组小鼠耳部皮肤组织病理形态（HE染色，×400）
正常组 模型组 阳性药组 中药高剂量组 中药低剂量组
图2 各组小鼠耳部皮肤组织AQP3表达（DAB染色，×400）
表1 各组小鼠皮肤组织中AQP3表达比较（—x±s，平均光密度值）
组别只数AQP3
正常组100.089±0.009
模型组100.168±0.012△△
阳性药组100.126±0.005△△▲
中药高剂量组100.131±0.006△△▲
中药低剂量组100.151±0.008△△▲
注：与正常组比较，△△P<0.01；与模型组比较，▲P<0.05
3 讨论
慢性湿疹的发病机制尚未完全阐明，其病理上常表现为棘层肥厚，表皮突显著延长，并有角化过度及角化不全，轻度的细胞间水肿。真皮上部血管周围炎细胞浸润，主要以淋巴细胞为多，毛细血管增多，内皮细胞肿胀、增生。本实验结果显示，除正常组外，其余各组均在不同程度上出现表皮增厚、角化过度、真皮上部炎细胞浸润、内皮细胞肿胀。模型组小鼠耳部病理结果显示，慢性湿疹模型复制成功，其病理变化基本符合慢性湿疹病理改变。而各给药组小鼠耳部病理变化较模型组均有不同程度的改善。
虽然慢性湿疹的发病机制尚不清楚，但有学者提出皮肤屏障破坏，导致角质层含水量下降可能是其重要原因[8]。AQP3在皮肤屏障功能中具有重要作用，其通过细胞内外渗透压的差异介导水进出细胞膜，从而参与水的分泌、吸收及细胞内外水的平衡，是维持体内水液代谢平衡的分子学基础。近年来，慢性湿疹发病机制与皮肤中AQP3表达受到关注。Nakahigashi等[9]经研究发现，AQP3过量表达可引起未成熟角质形成细胞增殖、表皮增生、皮肤屏障功能受损，从而增加外源性抗原入侵皮肤的机会和导致皮肤高反应性。宋氏等[10]研究显示，AQP3在慢性湿疹患者表皮全层可见强阳性表达，并推测AQP3在慢性湿疹皮损中表达增强，可能为代偿性补充角质层水分及甘油，维持皮肤屏障功能。
本研究采用免疫组化法检测小鼠皮肤组织中AQP3表达情况，实验结果表明，模型组皮损中AQP3表达显著增强，而病理上则表现为表皮角化过度，棘层肥厚，真皮血管周围炎性浸润明显，内皮细胞肿胀。笔者认为上述表现与脾虚有着密切联系。脾主运化，脾虚运化无权，水液不能正常输布，而余湿羁留不去；脾虚散精失调，可致血虚，日久化燥生风，肌肤失于濡润，最终形成脾弱血虚风燥的证候。经健脾养血祛风方干预后，组织病理表现为棘层肥厚明显减轻，真皮内炎性浸润显著减少，内皮细胞肿胀减轻。皮肤中AQP3表达明显下降，这可能是健脾养血祛风方治疗脾虚慢性湿疹的作用机理之一。方中党参、白术健脾益气除湿，共为君药；生地黄、当归养血活血润燥，共为臣药；制何首乌、鸡血藤养血活血通络，防风、蒺藜、白藓皮祛风除湿止痒共为佐药；甘草补脾益气，调和诸药，为使药。诸药合用，共奏健脾除湿、养血润燥、祛风止痒之效。
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（收稿日期：2014-11-08）
（修回日期：2014-11-30；编辑：华强）