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[摘要]失眠症在当今社会发生普遍，现代分子学已发现失眠症可能与γ氨基丁酸A（GABAA）受体机制、细胞因子调节机制、兴奋性氨基酸机制以及羟色胺（5HT）受体机制调节有关，但这些独立的机制与病理表征之间的联系仍不明确。而半夏厚朴汤作为治疗失眠抑郁的名方，其治疗机制尚不明确。为进一步探索半夏厚朴汤在治疗失眠过程中对已知或未知生物通路的作用，该研究采用基于1HNMR 技术的代谢组学研究方法，观察给予半夏厚朴汤提取物后对戊巴比妥钠诱导大鼠睡眠实验中，大鼠体内小分子代谢物的变化并对其机制进行探讨。通过采集大鼠尿液和血清进行核磁数据检测，利用主成分分析法（principal component analysis， PCA）对大鼠尿液和血清内源性小分子代谢产物进行分析处理。并运用Simcap 170（Umetrics，Umea，Sweden）和Chenomx NMR Suite 71（Chenomx，Inc.，Edmonton，Alberta，Canada）软件对核磁共振氢谱和相关代谢产物进行鉴定和分类。 结果表明，半夏厚朴汤组和茚地普隆组与空白组区别明显，载荷图中显示最大变异代谢物，发现10个代谢物质在组间存在显著性差异。实验证明，半夏厚朴汤组和茚地普隆组均可延长戊巴比妥钠诱导大鼠睡眠时间，且半夏厚朴汤与戊巴比妥钠有协同作用。经过代谢物差异性对比，推测半夏厚朴汤对戊巴比妥钠诱导大鼠睡眠实验机制可能是通过调节谷氨酰胺、磷酸肌酸、2酮戊二酸的含量，减轻脑内神经兴奋性从而起到调节睡眠的作用。
[关键词]代谢组学；半夏厚朴汤；1HNMR技术；镇静催眠
[Abstract]Insomnia was a common disease， which might be correlated with γaminobutyric acid A （GABAA） receptor mechanism， cytokine regulatory mechanism， excitatory amino acid mechanism and hydroxytryptamine （5HT） receptor mechanism， but the correlations between these independent mechanisms and pathological characterization were still unclear To further explore the effect of Banxia Houpo decoction on known or unknown biological pathways during treatment of insomnia， the metabonomics method based on 1HNMR was developed for detecting the significant changes in metabolomics after the administration with Banxia Houpo decoction in pentobarbital sodiuminduced rat sleeping experiment Serum and urine samples were analyzed by 1HNMR Principal component analysis （PCA） was carried out for endogenous small molecule metabolites in urine and serum HNMR spectroscopies and relevant metabolites were found and identified by Simcap 170 （Umetrics， Umea， Sweden） and Chenomx NMR Suite 71 （Chenomx， Inc， Edmonton， Alberta， Canada） software The result suggests that Banxia Houpo decoction group and indiplon group had significant differences The load diagram showed the biggest variation metabolites and intergroup significant differences among 10 metabolic substances According to the experiment， Banxia Houpo decoction group and indiplon group can prolonge the sleeping time of pentobarbital sodiuminduced spraguedawley rats， with a synergistic effect The significant changes of these biomarkers indicated that the Banxia Houpo decoction could aid sleep by adjusting the content of glutamine， creatine phosphate， 2oxoglutarate， and reducing the activity of brain nerves
[Key words]metabonomics； Banxia Houpo decoction； 1HNMR； sedative hypnotic
doi：10.4268/cjcmm20160824
代谢组学（metabonomics或metabolomics）为在特定时间内系统性分析生物体液或生物组织中代谢物的差异性表达。代谢组学在中药高通量筛选和全面技术研究方面应用广泛，其整合运用将会成为整合化学物质组学的系统生物学的关键环节[12]，在其应用分析技术中核磁共振技术以其高通量分析及样品无损性分析的特点而被广泛应用[35]。
失眠症在当今社会发生普遍，长期失眠易使人产生焦虑、烦躁、抑郁等精神症状。如今国内、外常用镇静催眠药物治疗失眠症容易产生副作用和依赖性，然而中药治疗失眠的副作用小，无成瘾性，因此有较大的发展空间[68]。半夏厚朴汤始载于《金匮要略》，为治疗梅核气的名方，由半夏、厚朴、茯苓、苏叶、生姜5味药组成，临床多用于情志不遂、肝气郁结导致的痰凝。然而，此症病人由于情志不畅，气滞痰阻，常伴有心烦、失眠等症[910]。关于半夏厚朴汤镇静催眠的药理作用已有相关实验报道得到验证[11]。本实验以代谢组学为研究方法，通过研究半夏厚朴汤对SD大鼠注射戊巴比妥钠诱导催眠模型的观察，并对不同组别大鼠的尿液和血清进行1HNMR分析，通过比较各组代谢物的差异，探讨半夏厚朴汤对戊巴比妥钠诱导大鼠镇静催眠的作用和机制。
1材料与方法
11药材半夏厚朴汤全方（半夏130 g，厚朴45 g，茯苓60 g，紫苏30 g，生姜75 g），加10倍量水浸泡过夜后，煎煮1 h，用纱布过滤，第2次和第3次煎煮加8倍量水，煮沸回流1 h，合并3次滤液，抽滤，减压浓缩至浸膏状，减压浓缩至305 mL药液，浓缩液和药材之比为656∶1（相当于1 mL含生药655 g）， 将实验所得浸膏置4 ℃冰箱中备用。
12试剂与仪器茚地普隆，军事医学科学院放射与辐射医学研究所制；生理盐水，石家庄四药有限公司；戊巴比妥钠，北京化学试剂公司（德国进口分装）；叠氮化钠（NaN3），英国Alfa Aesar 化工有限公司；磷酸二氢钠（NaH2PO4，纯度≥990%）和磷酸氢二钠（Na2HPO4，纯度≥990%），美国Sigma化工有限公司；重水（D2O，光谱纯），美国CIL有限公司；3（三甲基硅基）氘代丙酸钠（TSP），加拿大默克公司。
恒佳DT1001A电子天平，常熟佳衡天平仪器有限公司；大鼠不锈钢代谢笼，北京龙东海科研设备制造有限公司；Finnpipette微量移液器，芬兰雷勃（集团）有限公司；台式离心机，上海安亭科学仪器厂，JEOL ECA 400 MHz磁共振谱仪，日本JEOL电子公司。
13动物与分组选取雄性SD大鼠为实验动物，体重（180±20） g，购自军事医学科学院实验动物中心，合格证号SCXK（军）20120004。适应5 d后，将实验动物随机分为3组。所有大鼠均单代谢笼饲养。温度（23±1）℃、相对湿度保持50%～60%，12 h光/暗循环（光照时间 8：00～20：00），自由进食饮水。在实验开始前每天给予连续5 min的抚摸适应，3 d后大鼠随机分组，每组6只，共18只。每组分别为空白组（生理盐水，5 mL），阳性对照组（茚地普隆，5 mg·kg-1）、半夏厚朴汤组（500 mg·kg-1），浸膏干粉加生理盐水配成溶液，每天灌胃给药1次（各组给药体积相同），共14 d。
14实验数据采集与处理在最后一次给药后30 min，于大鼠腹腔注射戊巴比妥钠40 mg·kg-1，并将大鼠腹部朝上放在温暖（37 ℃）的垫块上，以翻正反射消失为入睡时间，翻正反射消失至恢复的时间为睡眠持续时间（大鼠翻正反射消失1 min以上则为发生睡眠），记录各组大鼠的睡眠时间[1213]。诱导催眠实验结束后，用代谢笼法收集最后一次给药后各组大鼠的尿液（24 h），集尿于EP 管中，并置于生物冰袋中，每10 mL加05 mL 01%NaN3溶液防腐。收集到的尿样3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，实验前于-80 ℃ 冰箱储存。实验结束后注射2%戊巴比妥钠（40 mg·kg-1）麻醉，解剖大鼠并于下腔静脉取血，放置10 min，4 ℃ 离心（12 000 r·min-1，15 min），取上清液，于-80 ℃冰箱中保存备用。NMR实验前，将血清和尿样于4 ℃环境解冻，以D2O稀释，02 mol磷酸盐缓冲液调节pH，加入5 mmol TSP内标溶液。将混合溶液于4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min， 取500 μL上清液于5 mm NMR管中，进行NMR数据采集。
在核磁共振仪上采集数据参数如下：谱宽4 800 Hz，混合时间03 s，驰豫延迟时间12 s，温度25 ℃，采样点数64 k，累加次数64次；在驰豫延迟期间采用多脉冲梯度场回波（multiple pulse field gradient echo，MPFGE）脉冲序列抑制水峰，谱仪偏置设置在水峰的位置。自由感应衰减（free induction decays，FID）信号经过傅立叶变换转换为NMR图谱。进行一维核磁共振1HNMR实验数据采集[14]。将各组的图谱利用MestReNova 602软件进行相位校正与基线校正后，将谱图以所有信号按峰面积归一化为1，以TSP为化学位移参考峰，定为000。并对1HNMR 谱图进行分段积分（尿样为δ 002，血清为δ 001），并且排除溶剂峰和尿素峰（δ 520～460）积分区段[14]。数据处理后导入Excel。通过Simcap软件进行主成分分析，结果以得分图和载荷图表示。
2结果
21实验数据分析与处理所有数据，包括睡眠时间，1HNMR数据等，均使用SPSS 170 （Umetrics，Umea，Sweden） 进行定性分析，各实验组灌胃给药后对戊巴比妥钠诱导大鼠睡眠时间和1HNMR数据采用单因素方差分析。实验组与对照组的差异显著性分析采用成对样本t检验，结果见表1。
经统计分析可得，半夏厚朴汤组与生理盐水组有显著性差异（P<001），和茚地普隆组无显著性差异。即半夏厚朴汤组与茚地普隆组的催眠作用相差不大，与戊巴比妥钠有协同催眠作用。
22血清和尿液1HNMR检测将实验所得的核磁图谱借助软件Chenomx NMR Suite 71（Chenomx，Inc.，Edmonton，Alberta，Canada）中代谢产物的自动解析功能，初步分析得到10个差异性代谢物。将这些差异性代谢物结合HMDB和Metlin标准代谢物谱图库对尿样和血清中的代谢物进行指认。将1HNMR谱图中代谢物与代谢物数据库生物代谢标准物图谱进行比对归属。根据NMR谱图中化合物的化学位移、峰形、半峰宽、耦合裂分等情况进行调整校准，将标准化合物和生物体液样本的特征信号逐一匹配，能够鉴定出尿样和血清样本中共10个代谢物。
大鼠血清和尿样的PCA得分图见图1。血清PCA图上看出，半夏厚朴汤组与第1组成分相关性较大，3组数据点能很好的分开。说明3组之间血清代谢物有明显差异，半夏厚朴汤和茚地普隆均影响了大鼠体内血清代谢物的成分含量。尿液PCA图中可以看出，半夏厚朴汤组和茚地普隆组与第1主成分相关性大，且2组相距较近，与空白组之间差异性较大，能够与其明显区分开来。结果说明半夏厚朴汤组与茚地普隆组差异不明显，这一结果与本催眠实验行为学水平与报道的实验研究相一致。
通过Simcap软件进行主成分分析，从PCA荷载图和VIP值（variable importance in projection）图得到差异性较大的代谢产物（VIP>1的位移点可能为差异性显著的物质），结合chenomox软件自动解析得到体内小分子代谢物的变化，发现供能物质葡萄糖水平升高，见表2。葡萄糖有氧氧化被抑制，ATP生成减少，于是细胞进行无氧酵解以代偿能量不足，以致产生更多的乳酸和丙酮酸。对照组和实验组代谢物中葡萄糖均升高，说明半夏厚朴汤影响到大鼠体内糖异生的代谢。
3讨论与结论
牛磺酸是含硫氨基酸的代谢产物，它的抗氧化活性可以保护细胞膜和其他细胞成分， 在半夏厚朴汤组与茚地普隆组中牛磺酸含量均减少，这与含硫氨基酸分解代谢异常有关。胆碱在哺乳动物体内被氧化成甜菜碱。甜菜碱参与磷脂酞胆碱的合成，可提高肌肉中肉碱的含量，促进脂肪酸β氧化，保护机
肌酸和磷酸肌酸代谢产物之一为肌酸酐，肌酸酐和磷酸肌酸浓度减少是引起疲劳的重要因素[16]。半夏厚朴汤组较生理盐水组磷酸肌酸增加，增强了机体能量的转移，增加了能量代谢。2酮戊二酸、延胡索酸为三羧酸循环（TCA）的中间产物，在能量代谢过程中扮演着重要角色，它们在机体含量出现异常，便可能引起 TCA 功能缺失或紊乱。同时，2酮戊二酸是体内多种转氨酶的受体，可以与体内代谢产生氨结合，在哺乳动物体内，过量氨会影响大脑代谢，改变神经递质水平。因此半夏厚朴汤组和茚地普隆组2酮戊二酸、延胡索酸水平升高，可能是大鼠体内氨水平所致，氨极易通过血脑屏障，使得脑细胞中 2酮戊二酸水平变化，TCA增强，能量生成增加，从而缓解机体出现疲劳怠倦的症状[1719]。
谷氨酸是兴奋性氨基酸，在中枢内分布极为广泛，以大脑皮层和髓背侧部分水平相对较高，是主要兴奋性递质，对中枢神经系统所有神经元均起兴奋作用，使神经元放电，其释放量的增加与睡眠质量呈负相关，在失眠中起重要作用[20]。谷氨酰胺是体内最丰富的游离氨基酸之一，是淋巴细胞分泌、增殖及其功能维持所必需的物质。在半夏厚朴汤组相比于生理盐水组变化中发现，谷氨酸的含量降低，可推测其治疗失眠的机制可能是通过调节谷氨酸含量来减轻脑内兴奋神经性，起到了保护脑神经元的作用，从而起到催眠的作用。与传统实验研究相比，本实验在证实半夏厚朴汤具有镇静催眠的基础上还进一步探索了半夏厚朴汤对失眠症治疗的可能作用机制。另外，根据文章报道，失眠抑郁症状还可能与5HT含量不足有关，能够升高突触间5HT含量的药物可缓解此类症状[2122]。
此外，作为阳性对照组的茚地普隆是临床用于镇静催眠的代表药物，其主要作用机制为选择性作用于人体中枢 GABAA 受体[23]。从各组代谢物差异分析得出，茚地普隆组与半夏厚朴汤组虽行为学有相似的作用，但与代谢物相比却有不同，可能是作用机制不同所致。因此关于半夏厚朴汤对戊巴比妥钠诱导大鼠睡眠尚需进一步探索证明。
半夏厚朴汤的实验研究虽有报道，但多数集中于对其作用的验证方面，对其作用机制则研究较少。本实验首先从代谢组学的角度探究半夏厚朴汤的镇静催眠作用，通过将实验大鼠的血清和尿液进行核磁分析并结合行为学水平，从2个层面探求半夏厚朴汤的作用机制。实验结果表明，半夏厚朴汤与戊巴比妥钠具有镇静催眠的作用，同时推断半夏厚朴汤在大鼠体内通过调节谷氨酰胺、磷酸肌酸、2酮戊二酸的含量以减轻脑内神经兴奋性从而起到诱导睡眠的作用。
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[责任编辑曹阳阳]