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【摘要】 目的：拟寻求一种更好的大鼠体脑组织灌注方法以提高灌注固定效果。方法：健康雄性SD大鼠经10%水合氯醛进行麻醉，暴露心脏和主动脉弓，以小动脉夹夹闭胸主动脉，用动脉留置针在大鼠心尖波动最明显处进针，进入约0.5 cm时，边退出针芯，边将套管自左侧心室推送至升主动脉直至套管针尾部，并关闭套管针尾端的开关，防止血液外溢，连接输液管，剪破右心耳，依次从心脏灌注0.9%复方氯化钠注射液和4%多聚甲醛固定脑组织。结果：脑组织灌注所需的灌注液减少，灌注插管时间及总灌注时间均缩短，且灌注后脑组织更硬、色泽更白。结论：采用此种灌注方法后，其灌注固定效果明显提高，且操作过程简单易行，值得推广。
【关键词】 动脉留置针； 大鼠； 脑组织； 灌注
In Vivo Perfusion Method of Artery Remaining Needle Applied to Rat Brain Tissue/WEI Xiao-yong，LU Bo，MIN Hong-xing，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（24）：014-016
【Abstract】 Objective：To seek a better method for in vivo perfusion of rat brain tissues and improve the efficiency of perfusion fixation.Method：The healthy male SD rat was anesthetized by 10% chloral hydrate， exposed the heart and aortic arch，clipping the thoracic aorta with small arteries clip， with artery remaining needle in the tip of the heart of the rat fluctuation most obviously needled into about 0.5 cm，exited the needle core，at the same time pushed the cannula from the left ventricle to the aorta until the trocar tail，and closed the cannula needle end of the switch to prevent blood spills，then connected with the infusion pipe and cuted the right auricle，fixation brain tissue from the heart perfused sequentially with 0.9% compound sodium chloride injection and 4% paraformaldehyde.Result：The required perfusion fluid of Cerebral tissue perfusion was reduced，perfusion intubation time and total perfusion time was shortened，and the brain tissue after the infusion was harder，the color was more white.Conclusion：By this method of perfusion，the perfusion fixation effect is obviously improved and the operation process is simple and easy to operate， which is worthy of promotion.
【Key words】 Artery remaining needle； Rat； Brain tissue； Perfusion
First-author’s address：Ningxia Medical University， Yinchuan 750004，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.24.005
免疫组化等病理学实验研究中，为避免脑组织细胞的变形及自溶现象，动物处死前需行灌注固定处理[1-2]，故动物在体脑组织的灌注固定效果对试验结果尤为重要。就脑组织灌注固定方面，报道的文献不少，有经心脏灌注、颈总动脉灌注、经股动脉灌注等方法；灌注过程中有夹闭腹主动脉、胸主动脉等；灌注针有用静脉输液器针、自制灌流针（去掉输液器针头的针尖或12-16号针头上套一长约1.5 cm的塑料管并将塑料管前端剪成针尖状）和普通针头等。对此，为寻求一种操作简单易行且灌注固定效果好的方法，笔者在大鼠体脑组织的灌注固定实验过程中，采用动脉留置针夹闭胸主动脉经心脏灌注的方法，现将实验操作过程的体会介绍如下。
1 材料与方法
1.1 试剂和器械 BD动脉留置针（货号：REF682245，规格型号：20 G、1.10 mm× 45 mm、49 mL/min），见图1，4%多聚甲醛新鲜配置（天津市光复精细化工研究所），0.9%复方氯化钠注射液（500 mL/4.5 g、宁夏启元药业），10%水合氯醛（成都金山化学试剂有限公司），三通（舒尔康、批号：120225）、止血钳、组织剪、眼科剪、小动脉夹、皮镊、输液管（2副）等。
图1 BD动脉留置针
1.2 实验动物 选取体重450～500 g，健康雄性18个月龄SD大鼠24只[购于宁夏医科大学动物实验中心，清洁级，合格证号：SCXK（宁）2011-0001]，常规条件下饲养，自由饮水，普通饮食。
1.3 实验方法 将灌注所用的0.9%复方氯化钠注射液加热至37 ℃[3]、新鲜配置4%多聚甲醛滤去杂质 [3]、输液管（两副输液管用三通连接好）、手术器械等物品准备就绪后，放置盛有上述0.9%复方氯化钠和4%多聚甲醛的输液瓶距离操作台1.5 m高的位置[4]。雄性SD大鼠经10%水合氯醛（0.4 mL/100 mg）麻醉，待大鼠反正反射消失后，将其仰卧位于实验台上，固定头部和四肢，暴露胸部，沿胸骨中线自剑突向上依次剪开皮肤和胸骨，充分暴露胸腔，显露心脏和主动脉弓，迅速用皮镊提起左侧肺，可见其下位于大鼠脊柱左侧的胸主动脉（ 胸主动脉右侧为食管） [5]，以小动脉夹夹闭胸主动脉。并迅速用眼科剪剪开心包，用动脉留置针在心尖波动最明显处进针，进入约0.5 cm时，右手往外退针芯，同时左手持针翼将套管自左侧心室推送至升主动脉直至套管针尾部，此时，关闭套管针尾端的开关，防止血液外溢，连接输液管，剪破右心耳，打开套管尾端和输液管开关，灌注0.9%复方氯化钠注射液，先快后慢，待自右心耳流出液体颜色清亮，此时旋转三通开关，由快及慢灌注4%多聚甲醛，待大鼠颈部及上肢僵硬，说明灌注固定成功[6]。随后断头取脑，之后将脑组织置于4%多聚甲醛固定4 ℃保存[7]。
1.4 观察指标 （1）观察并记录灌注后大鼠组织的色泽、质感及是否含有血丝。（2）观察并记录实验中所用的0.9%复方氯化钠注射液和4%多聚甲醛的量、灌注插管时间、总灌注时间。灌注插管时间是指从针进入心尖开始至插管成功所用时间，总灌注时间是从针进入心尖开始至灌注固定成功所用时间。（3）观察并记录灌注过程中大鼠颈部、胡须、四肢和尾巴是否抽搐。（4）观察并记录灌注过程中是否发生肺循环灌注。发生肺循环途径灌注的现象时鼻腔中会有灌流液流出 [8]。（5）观察并记录在灌注插管过程中损伤血管、穿破心腔和灌注过程中套管脱出等不良事件的发生率。
2 结果
灌注后大鼠脑组织呈乳白色，质地较硬，且未含血丝（图2）。实验中所用的0.9%复方氯化钠注射液和4%多聚甲醛的量分别为（107±9.2）mL、（175±17.3）mL，灌注插管时间和总灌注时间分别为（10±1.8）s、（41±4.1）min。灌注过程中大鼠颈部、胡须、上肢明显抽搐，下肢及尾巴未抽搐。灌注过程中均未发现大鼠鼻腔中有灌流液流出，故未发生肺循环灌注。灌注插管过程中未出现损伤血管、穿破心腔和灌注过程中套管脱出等不良事件。
图2 灌注后大鼠脑组织
3 讨论
免疫组化等病理学实验研究中需对组织进行定性、定位或定量研究。因此，在组织切片之前，需对组织进行灌注固定，因为固定好的组织能抑制细胞内溶酶体酶的释放和活性， 防止自溶；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐败，使细胞的蛋白质、脂肪、糖等各种成分凝固成不溶性物质，以防止物质扩散，维持原有组织的形态结构[9]。大鼠在体脑灌注过程中，通过大鼠天然的循环系统直接进行灌注固定，固定液可快速、均匀地分布到脑组织各个部位，所以脑组织标本制备多采用此法[10-11]。
灌注固定主要坚持两个原则：一要尽量保持活体的状态；二要尽量行动迅速从而避免动物长时间处于痛苦和濒死状态，引起病理假象，从而干扰科研结果[12]。目前，据文献[12]报道，小动物灌注多采用经心脏灌注方法，而经颈总动脉因操作难度大，费时而逐渐被淘汰。脑组织灌注过程中为节省灌注液，依研究报道有夹闭腹主动脉、胸主动脉等[5]，但夹闭腹主动脉需进行开腹，增加操作难度，延长灌注总时间，降低实验效率。灌注针是保证整个灌注过程的必要条件，因此，灌注针的选择对整个灌注过程尤为重要。有研究报道灌注针可用静脉输液器针[8]、自制灌流针[5，13-14]和普通针头[14]等，这些灌注针虽可进行灌注，但都有各自弊端。如静脉输液器针和普通针头因针尖锋利，在插管过程中可刺破心脏及心室，且易脱出，使灌注失败或发生肺循环灌注。而自制的灌流针[5，13]，一般因针尖钝圆，不易刺入心脏，需借助眼科剪[12]，又因心脏跳动，增加眼科剪的操作难度，在心尖处剪的口可能过大或过小，也可能剪破心脏，影响灌注固定效果，而通过剪口，插入灌注针，动作要轻慢[5]，从而延长灌注时间甚至导致灌注失败。陈浩宇等[14]自制的灌注针因塑料前端成针尖状，在灌注插管时可损伤血管及心腔，并可能引起肺循环灌注。
因此，笔者采用动脉留置针夹闭胸主动脉经心脏灌注的方法，可避免上述弊端，且依据许晓泉等[15]研究，在灌注开始时加热至37 ℃的0.9%复方氯化钠注射液的速度要快，能更好地排出脑组织内的血流，灌注新鲜配置滤去杂质的4%多聚甲醛时速度需放慢，让多聚甲醛在脑组织内停留更长的时间，以便有效固定。本实验结果表明：灌注过程中大鼠颈部、胡须、上肢明显抽搐，下肢及尾巴未抽搐，说明完全夹闭胸主动脉，可节省灌注液；另外，灌注过程中未发生肺循环灌注，保证了体循环灌注的效果，进而灌注后大鼠脑组织呈乳白色，未见血丝，且质地较硬；灌注插管时间仅用了（10±1.8）s，可见操作简单且节约时间；灌注插管过程中未出现损伤血管、穿破心腔和灌注过程中套管针脱出等不良事件，保证了灌注过程顺利进行，且可节约实验成本。
本研究的创新点：采用动脉留置针为灌注针，在整个灌注过程中，发现采用动脉留置针具有以下优势：（1）进针易：动脉留置针芯针尖锋利，心尖处进针容易，进针约0.5 cm时退出针芯，将套管从左心室顺利推送至升主动脉，可节约灌注插管时间；（2）出血少：动脉留置针套管的外径较针芯大[16]，可完全占据心尖穿刺点，减少出血；（3）损伤小：在退出针芯推送套管过程中，由于套管顶端钝圆，可避免损伤心腔及升主动脉；（4）推送顺：动脉留置针套管原料采用聚四氟乙烯，管壁硬度适宜、光滑，可顺利推送至升主动脉；（5）明插管：在动脉套管推送过程中，可看到套管进入升主动脉的全过程，确保插管成功，同时可避免肺循环灌注的发生；（6）易固定：套管尾端两侧有针翼，较其他灌注针容易固定；（7）难脱出：动脉套管长度45 mm，插管成果后，套管很难脱出，有利于灌注的顺利进行；（8）速度可：动脉留置针套管管腔直径1.10 mm，流量49 mL/min，可保证灌注速度，强化灌注效果，节约灌注时间和灌注液。
综上所述，本实验操作简单，灌注插管迅速、损伤小，可避免肺循环灌注，总个灌注过程省时、省液，且灌注固定效果好，值得推广应用。
参考文献
[1]季正剑，张冬霞，张立波，等.大鼠在体脑组织灌流方法的比较[J].实验动物与比较医学，2009，29（6）：390-392.
[2]郭林芝，李灵敏. 大鼠脑组织石蜡切片免疫组化的体会[J].山西医科大学学报，2013，44（4）：311-312.
[3]刘乃慧，张莉，邵颖，等. 在体心脏灌流术在大鼠脑组织切片观察中的应用[J].实验动物科学与管理，2005，22（2）：52-53.
[4]高永强，杨巧莲，王伟.大鼠局灶性脑缺血模型制备及取脑方法实验研究[J].包头医学院学报，2009，25（4） ： 6-9.
[5]卢文朋，栗世方.大鼠脑组织灌注固定方法的改进[J].医学研究生学报，2014，27（6）：627-629.
[6]李晶晶，朱鸿，施彩虹.三种方法对大鼠视网膜固定效果的比较研究[J].上海交通大学学报（医学版），2011，31（8）：1105-1107.
[7] Stoltenberg M，Danscher G，Pamphlett R，et al.Histochemical tracing of bismuth in testis from rats exposed intraperitoneally to bismuth subnitrate[J].Reproductive Toxicology，2000，14（14）：65-71.
[8]王章敬，李煌元.静脉输液器应用在小鼠体脑组织灌注方法[J].微量元素与健康研究，2014，31（1）：9.
[9]陈广斌，谢玲，林坚涛.不同固定方法对新生大鼠脑组织切片的影响[J].中国民康医学，2008，20（15）：1730-1731.
[10]陈玉玺，王晓莉，牟青杰，等.骨髓间充质干细胞对脑缺血大鼠星形胶质细胞影响的实验研究[J].医学研究生学报，2013，26（6）：564-567.
[11]李丹，王志萍，宗剑，等.富氢液联合浅低温对大鼠脑缺血再灌注海马氧化应激水平的影响[J].医学研究生学报，2012，25（1）：26-30.
[12]周传龙，方剑乔，邵晓梅.大动物灌注固定方法的探讨[J].实验动物科学，2010，27（1）：70-71.
[13]刘海燕.灌注固定大鼠的技术操作及常见问题[J].齐齐哈尔医学院学报，2006，27（11）：1341.
[14]陈浩宇，高亚兵，彭瑞云，等.一种改进的大鼠脑组织灌注固定方法[J].军事医学科学院院刊，2002，26（3）：208-212.
[15]许晓泉，刘圣，祖庆泉，等. 在体脑灌流技术在犬脑梗死实验研究中的应用[J].江苏医药，2011，37（20）：2357-2359.
[16]蔡云亮，潘春杰，王新，等. 动脉留置针颈内静脉直接穿刺置管在休克抢救中的应用[J].广东医学院学报，2014，32（3）：386-388.
（收稿日期：2015-01-30） （本文编辑：陈丹云）