打开文本图片集
液体发酵菌丝粗多糖（CPSM）对小鼠体内免疫相关器官的相对重量、小鼠血清中的天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性的影响；结果表明，经CCl4诱导小鼠的肝脏、脾脏和胸腺指数上升，AST和ALT活性剧烈升高；小鼠预先灌胃CPSM能缓和这些器官指数和酶活的变化，其中高剂量组（20 mg/100 g BW）与灌胃水飞蓟素的阳性对照结果相当。以BHT为阳性对照，检测CPSM的体外抗氧化活性表明，CPSM对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子的清除能力在实验范围与用量呈正相关关系，在100 μg/mL时，对DPPH、OH和O-2的清除率分别为32%、56%和48%。
粗多糖； 保肝； 抗氧化； 大秃马勃
马勃（Calvatia spp）是大型食药用真菌，其营养成分十分丰富，一些研究者从马勃中分离鉴定了10种甾醇类， 6种三萜类，5种氨基酸或盐的化合物及一些蛋白质、多肽、多糖、微量元素等成分[13]。在《名医别录》上就有记载，其味辛性平，入肺经，有消肿、止血、解毒等功效。在2010年出版的中国药典中收录的马勃主要为大秃马勃（Calvatia gigantea Lloyd），脱皮马勃（Lasiosphoera fenzlii Reich）或紫色马勃（C. lilacina Lloyd）的干燥子实体，其中的大秃马勃子实体主要是以药用为主。现代研究表明，大秃马勃具有抑菌、消肿、解毒、止痛、清肺、抑肿瘤等功效[46]，但对于肝损伤的保护作用未见报道。四氯化碳、亚硝胺、多环芳烃等具有肝毒性物质能诱导肝损伤，并产生不同程度肝组织变性和肝细胞死亡。笔者参照文献[79]，以大秃马勃液体培养菌丝粗多糖（crude polysaccharide from submerged mycelia， CPSM） 为材料，比较了不同灌胃剂量对其对四氯化碳造模小鼠肝损伤的保护作用，还进行了CPSM体外清除不同种类自由基的活性比较，旨在进一步了解大秃马勃的活性作用，为今后研发出真菌药物或保健品提供基础。
1 材料与方法
1.1供试材料
大秃马勃（Calvatia gigantea）菌种，购于广东省微生物菌种保藏中心。
雌性昆明种小白鼠购于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心（北京）。小鼠饲料购于江苏协同生物工程有限公司。小鼠饮用纯净水购于杭州娃哈哈集团公司。检测AST、ALT所用的试剂盒购自南京建成生物工程研究所。水飞蓟素是由德国马博士大药厂生产。
菲洛嗪、硫胺素、硫酸亚铁、磷酸二氢钠、氯化钠、甲醇、盐酸、邻二氮菲、1，1二苯基2苦基肼自由基（DPPH）；2，6二叔丁基4甲基苯酚、过氧化氢、焦性没食子酸、三羟基甲基甲烷等均为分析纯试剂。
1.2实验方法
1.2.1大秃马勃菌丝体粗多糖的制备工艺流程
大秃马勃菌种
SymbolnB@ 斜面活化
SymbolnB@ PDB摇瓶培养
SymbolnB@ 过滤
SymbolnB@ 菌丝体水洗
SymbolnB@ 60 ℃烘干
SymbolnB@ 粉碎
SymbolnB@ 热水浸提
SymbolnB@ 2378 g离心10 min
SymbolnB@ 收集上清液
SymbolnB@ 真空浓缩
SymbolnB@ 乙醇（终浓度80%）醇沉
SymbolnB@ 2378 g离心10 min
SymbolnB@ 冷冻干燥
SymbolnB@ 粗多糖，具体操作参见文献[10]。
1.2.2动物分组与实验设计
大秃马勃菌丝提取物对四氯化碳诱导小鼠肝损伤的影响研究参照HSU[1112]等报道的方法略作修改。
选取同批次健康的雌性小白鼠（体重为20±2 g）进行适应性饲养，6 d后选取体质健壮、体重相近的小白鼠分组，每组8只，共有6组。第1组为正常对照组（CKn）；第2组为肝损伤模型对照组（CKm）；第3组为阳性对照组（CKp）；第4组为大秃马勃菌丝提取物低剂量组（CPSM5）；第5组为大秃马勃菌丝提取物中剂量组（CPSM10）； 第6组为大秃马勃菌丝提取物高剂量组（CPSM20）。
小鼠饲养期间的环境温度～23 ℃，小鼠定量摄食～25 g/100 g Bw、自由饮水，鼠笼每天更换一次垫料。CKn和CKm组每天分别灌胃一次生理盐水5 mg/100 g BW，CKp组每天分别灌胃1%水飞蓟素5 mg/100 g BW；CPSM5、CPSM10和CPSM20组每天分别灌胃剂量为5、10、20 mg/100 g BW的CPSM。连续灌胃15 d后，第2～6组每只小鼠分别注射0.1%的CCl4（剂量为1 mL/100 g BW）致小鼠急性肝损伤，禁食16 h后，各小鼠分别称重、眼眶取血并离心分离血清、颈椎脱臼法处死小鼠后解剖取器官（肝脏、脾脏和胸腺），滤纸吸干血渍后分别称重计算相应器官指数， 指数（%）=W1/W0×100，其中： W0为小鼠体重（g），W1为器官重量（g）。
李作美，等：大秃马勃液体发酵菌丝粗多糖的肝损伤保护作用及体外抗氧化活性
1.2.3生化指标测定
小鼠血清中的天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）的活性的测定均采按照南京建成生物工程研究所研制的试剂盒说明书进行检测。
1.2.4粗多糖抗氧化活性
1.2.4.1清除DPPH
将DPPH溶液与甲醇溶液混合，全波长扫描后确定最大吸收的517 nm作为提取物的测定波长。试管中入DPPH和甲醇各2 mL摇匀后将其设为A组，测得结果为A0；样品溶液和甲醇各2 mL摇匀后将其设为B组，测得结果为A1；样品溶液和DPPH各2 mL摇匀后将其设为C组，测得结果为A2；室温避光静置30 min后517 nm处测OD值，甲醇为空白对照，BHT为阳性对照，每组处理各3各重复[13]。DPPH清除率计算公式如下：
X=[ A0 - （ A2 - A1）]/A0 × 100%
1.2.4.2清除羟自由基（OH）
取0.5 mL的0.75 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液于试管之中，依次加入1 mL磷酸钠盐缓冲溶液（0.15 mmol/L，pH 7.4）、0.5 mL的0.75 mmol/L FeSO4溶液，充分混匀后再加入0.5 mL的0.01%的H2O2，恒温水浴锅中37 ℃保温20 min， 536 nm处测OD值，测得数值为A组的A1；按照上述方法，用0.5 mL蒸馏水代替H2O2，测定B组的A2；用0.5 mL样品溶液代替H2O2，测定C组的A0；BHT作为阳性对照，每组处理各3各重复[14]。清除率计算公式如下：
X=（A0-A1）/（A2-A1）×100%
1.2.4.3清除超氧阴离子自由基（O-2）
将HClTris缓冲液（pH 8.2，浓度0.1 mol/L）和邻苯三酚溶液（50 mmol/L）在25 ℃水浴中保温备用；取5 mL 保温的HClTris缓冲液加入10 μL的邻苯三酚溶液（50 mmol/L），摇匀后325 nm处测OD值为A0，每隔0.5 min测一次，共测定5 min；取5 mL保温的HClTris缓冲液加入20 μL样品溶液再加入10 μL邻苯三酚溶液，摇匀如上方法测得OD值为A1。用10 mmol/L的HCl为空白对照组，BHT作为阳性对照，每组处理各3各重复[15]。清除率计算公式如下：
X=（A0 - A1） /A0 × 100%
1.2.5统计分析
实验结果数据表示为平均值±SD，并应用单因素方差分析和Duncan氏多重比较进行差异显著性分析。数据的分析比较都运用SPSS 18.0版本进行。
2 结果与分析
2.1大秃马勃菌丝提取物对小鼠体重的影响
每组小鼠经过连续灌胃15 d，禁食16 h后，测得体重分别为：CKn组：35.89±1.29 g，CKm组：34.05±2.11g，CKp组：35.22±2.48 g， CPSM5组：34.83±2.23g，CPSM10组：35.69±2.57g，CPSM20组：38.86±1.17 g，由以上数据可知，不同组别之间的小鼠体重无明显差异，这表明四氯化碳、水飞蓟素以及大秃马勃菌丝提取物对小鼠体重均不具有明显的影响。与正常对照组相比，阳性对照组和各给药组小鼠体重无显著性差异。
2.2大秃马勃菌丝提取物对小鼠器官重量及对小鼠血清中AST和ALT活性的影响
2.2.1大秃马勃菌丝提取物对小鼠器官重量的影响
从表1中可知，CKm组小鼠的肝、脾脏和胸腺较正常组明显增加，表明四氯化碳能诱导小鼠这些器官组织肿大；阳性对照和CPSM均能降低小鼠中的肝脏、脾脏和胸腺的相对重量，其中CPSM高剂量组作用与阳性对照相当。
2.2.2大秃马勃菌丝提取物对小鼠血清中AST和ALT活性的影响
由表1可知，CCl4肝损伤模型组较正常组中的小鼠血清AST和ALT活性显著上升，表明此小鼠体内试验建模成功。CKp与CPSM20的AST和ALT活性无显著差异，表明CPSM有较好的肝损伤保护作用。
2.3CPSM抗氧化测定结果
2.3.1清除DPPH的测定结果
由图1可见，在5 μg/mL～100 μg/mL 的实验范围内，随样品溶液浓度的增加，对DPPH的清除能力增强；当浓度为100 μg/mL 时，CPSM的清除率为32.0%，较阳性对照组BHT的清除率达到72.4%低40.4%。
2.3.2清除OH的测定结果
由图2可知，在实验范围内，随样品溶液浓度的增加，对OH的清除能力增强；当浓度为100 μg/mL 时，CPSM的清除率为54.6%，较阳性对照组BHT的清除率达到67.1%略低。
2.3.3清除O-2活性的测定结果
从图3可以看出， 在实验范围内，随样品溶液浓度的增加，对O-2的清除能力增强；当浓度为100 μg/mL 时，CPSM的清除率为47.0%，较阳性对照组BHT的清除率达到63.2%略低。
3 小结
釆用动物体内试验表明了CCl4能诱导小鼠肝、脾脏和胸腺器官组织的肿大。灌胃水飞蓟素的阳性对照组与大秃马勃菌丝提取物中剂量组和高浓度剂量组均能降低小鼠中的肝脏、脾脏和胸腺的相对重量，说明大秃马勃菌丝提取物对CCl4诱导的小鼠急性肝损有一定的保护作用。同时发现，CPSM对小鼠血清中的AST和ALT有一定的影响，灌胃CPSM能有效降低小鼠血清中的AST和ALT的活性，且随着大秃马勃菌丝提取物浓度的提高小鼠血清中的AST和ALT降低越明显。在抗氧化性方面，虽然和阳性对照组相比，抗氧化性相对较弱，但是CPSM还是能够清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基，具有一定的抗氧化作用。且浓度与清除率呈一定的量效关系。
郭玫，张扬.中药马勃的研究概况[J].甘肃中医学院学报， 2010， 27（1）：6062.
[2] 张庆康，丁永辉. 10种马勃的氨基酸含量测定及聚类分析[J].中成药， 1996， 18（8）：3537.
[3] 戴玉成，周丽伟，杨祝良，等.中国食用菌名录[J].菌物学报， 2010， 29（1）：121.
[4] 游洋，包海鹰.不同成熟期大秃马勃子实体提取物的抑菌活性及其挥发油成分分析[J].菌物学报. 2011， 30（3）：477485.
[5] 苏方华，潘日兴.马勃的抗炎镇痛实验研究[J].齐鲁药事， 2010， 29（10）：586588.
[6] 赵会诊，胥艳艳，付晓燕.马勃的食药用价值及其研究进展[J].微生物学通报， 2007， 34（2）： 367369.
[7] WANG YP， CHOI JH， JEONG HG. Protective effect of the Aralia continentalis root extract against carbon tetrachlorideinduced hepatotoxicity in mice[J]. Food Chem Toxicol， 2009， 47（1）：7581.
[8] FINKEL T， HOLBROOK NJ. Oxidants， oxidative stress and the biology of ageing[J]. Nature， 2000， 408（6809）：239247.
[9] VALKO M， LEIBFRITZ D， MONCOL J，et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease[J]. Int J Biochem Cell B， 2007， 39（1）：4484.
[10] 甘聃. 鼎湖麟伞菌丝体多糖的发酵条件优化、分离纯化、抗肿瘤活性及其机制的研究[D].南京：南京农业大学食品科技学院， 2012.
[11] HSU YW， TSAI CF， CHANG WH，et al. Protective effects of Dunaliella salinaacarotenoidsrich alga， against carbon tetrachlorideinduced hepatotoxicity in mice[J]. Food Chem Toxicol， 2008， 46（10）：33113317.
[12] CHEN JJ， MAO D， YONG YY，et al. Hepatoprotective and hypolipidemic effects of watersoluble polysaccharidic extract of Pleurotus eryngii[J]. Food Chem， 2012， 130（3）：687694.
[13] 包海鹰.大马勃生物药学研究[D].长春：吉林农业大学， 2011：4856.
[14] LI XM， LI XL， ZHOU AG. Evaluation of antioxidant activity of the polysaccharides extracted from Lycium barbarum fruits in vitro[J]. Eur Polym J， 2007， 43（2）：488497.
[15] LI X， ZHOU A， HAN Y. Antioxidation and antimicroorganism activities of purification polysaccharide from Lygodium japonicum in vitro[J]. Carbohydr Polym， 2006， 66（1）：3442.
[16] 李作美，许晖，曾晓雄.鼎湖鳞伞多糖抑菌和抗氧化活性研究[J]. 食品与发酵工业， 2013， 39（11）：166167.