摘 要：为进一步建立基于禽坦布苏病毒E囊膜蛋白的快速检测方法，本研究通过纯化的禽坦布苏病毒为抗原免疫BALB/c小鼠，获得2株杂交瘤细胞株（2F6和4E11），其分泌的单抗效价可达1∶64 000，并可有效识别禽坦布苏病毒感染的Vero 细胞；原核表达的囊膜E经SDS-PAGE电泳后可与单抗进行Western-blot发生反应，初步表明制备的单克隆抗体为禽坦布苏病毒E蛋白单抗，为该病分子流行病学研究及新型诊断方法建立奠定基础。
关键词：禽坦布苏病毒；单克隆抗体；E蛋白
中图分类号：S 852.65文献标识码：A文章编号：1008-0384（2018）06-551-05
Abstract：This study aimed to prepare and characterize monoclonal antibody （MAb） against avian Tembusu virus. BALB/c mice were immunized with the antigen of purified avian Tembusu virus， and then two MAbs named as 2F6 and 4E11 were selected. The two MAbs， with the titers of up to 1：64，000， were reacted with Vero cells infected with avian Tembusu virus. The Western blot analysis showed that both MAbs 2F6 and 4E11 were able to react with fusion envolope protein by prokaryotic expression， indicating that the two MAbs recognized the envelope protein. The prepared MAbs could be used to further explore the molecular epidemiology and development of new diagnostic methods for avian Tembusu virus infection.
Key words： Avian Tembusu virus； monoclonal antibody； envelope protein
2010年春季，我国浙江、福建、山东等东部地区鸭群中流行一种以产蛋骤降为主要特征的新病，患病种（蛋）鸭产蛋率从80%～95%下降至20%～30%，甚至停产，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失。研究人员从病死鸭的卵泡中分离到一株病毒，经病毒粒子观察、RT-PCR鉴定和序列测定，确定该病原为一种与坦布苏病毒关系密切的黄病毒科新成员，命名为鸭坦布苏病毒[1-4]。随后，该病陆续在鸡群和鹅群中流行[5-8]。因此，原先命名的鸭坦布苏病毒病被更名为禽坦布苏病毒病[9]。
黄病毒可编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白[10]。其中囊膜蛋白E是黄病毒的主要结构蛋白，位于成熟病毒粒子表面并形成突起，在病毒-靶细胞结合、膜融合和病毒入侵等过程中起着重要作用；同时，E蛋白为宿主抗感染免疫的主要保护性抗原，是诱导该病毒的特异性抗体的靶抗原[11]。禽坦布苏病毒作为黄病毒科重要成员，对其E囊膜蛋白的研究成为当前研究的热点之一，特别是如何建立起基于E囊膜蛋白的快速检测方法。当前，国内研究人员先后建立制备出E囊膜蛋白单克隆抗体，为禽坦布苏病毒快速检测及相关研究奠定了基础[12-15]。本研究以禽坦布苏病毒为抗原免疫BALB/c小鼠，获得2株可与禽坦布苏病毒E蛋白反应的单克隆抗体，为该病分子流行病学研究及新型诊断试剂研制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 病毒、细胞与试验动物
禽坦布蘇病毒WR株由本研究室分离鉴定并保存[1]。骨髓瘤细胞（SP2/0）购自中国科学院细胞库。4～8周龄BALB/c雌性小鼠购自中国科学院上海实验动物中心。
1.2 试剂和仪器
DMEM高糖培养基和胎牛血清购自Gibco公司；HRP标记山羊抗小鼠IgG和FITC标记兔抗小鼠IgG，购自碧云天生物技术研究所； HAT、HT、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；抗体分类试剂盒购自Southern Biotech公司；酶标仪购自BioTek公司， 低温超速离心机Optima-80k为Beckman公司产品。
1.3 抗原的制备
收集禽坦布苏病毒WR株感染的半番鸭胚尿囊液，于4℃、10 000 r·min-1离心20 min，取上清于4℃、50 000 r·min-1（Beckman，Ti70）超速离心1.5 h，沉淀用PBS重悬，同时通过蔗糖梯度离心初步纯化后经超速离心浓缩，储存于-70℃作为抗原备用。
1.4 动物的免疫
参照孙东波等的方法[16]，取病毒WR株抗原与等体积弗氏完全佐剂混合均匀后乳化，皮下多点注射免疫6 周龄的 BALB/c 雌性小鼠，每只抗原量为100 μg·只-1，间隔 14 d加强免疫，免疫时用等量病毒抗原与弗氏不完全佐剂乳化后接种，二免2周后加强免疫，3 d后取小鼠脾脏进行融合。
1.5 间接 ELISA 检测方法的建立
参照文献[17] 用方阵法确定抗原、抗体工作浓度，用0.05 mol·L-1 的碳酸盐缓冲溶液（pH 9.6）将病毒稀释成 10、5、2.5、1.25、0.625和0.312 5 μg·mL-1 等6个浓度包被酶标板，每孔100 μL，放置4℃过夜后用含有0.05% Tween-20的PBS缓冲液（PBST）洗板3次，以去除未吸附的抗原，以5%脱脂乳37℃封闭2 h。禽坦布苏病毒阴阳性血清作1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600和1∶3 200倍比稀释后加入酶标板，37℃孵育1 h，洗板后加入HRP标记的羊抗鼠IgG（HRP-IgG），TMB避光显色10 min后终止反应。于酶标仪上读取 OD450吸光值，选择阳性血清孔（P）的OD值约等于1.0、阴性血清孔（N）的OD 值<0.2、P/N值最大的抗原抗体最大稀释度为最佳工作浓度。
1.6 细胞融合
按常规方法[18]将活性较好的骨髓瘤SP2/0细胞与制备的BALB/c小鼠脾细胞按比例混匀，室温条件下1 000 r·min-1水平离心5 min，弃上清，通过轻搓离心管使细胞沉淀分散成糊状，将离心管置于37℃水杯中，缓缓加入37℃预热的PEG/DMSO solution，随后加入基础培养基20 mL终止反应，低速离心后细胞沉淀用10%胎牛血清的HAT 的DMEM细胞培养基重悬，分装到已铺有饲养细胞的96孔细胞板中，并放置CO2培养箱中培养。
1.7 杂交瘤细胞株的筛选与亚克隆
于融合后第6 d和第10 d采用半换液的方式更换HAT培养基，并于融合后12 d取细胞培养上清进行间接ELISA筛选阳性孔，随后对这些阳性孔进行亚克隆。克隆前，制备好饲养细胞，将阳性孔的杂交瘤细胞轻轻吹起，台盼蓝计数后，根据有限稀释法进行亚克隆，重复3 次，直至所有细胞孔培养上清检测为阳性率100%为止。
1.8 单克隆抗体腹水的制备
取15周龄的BALB/c雌鼠于腹腔注射降植烷，0.5 mL·只-1，一周后通过腹腔注射筛选的杂交瘤细胞，1×106个·只-1，待BALB/c雌鼠腹部膨胀后无菌采取腹水，10 000 r·min-1 离心5 min，并用间接ELISA检测其效价。
1.9 间接免疫荧光试验（IFA）
用禽坦布苏病毒WR株细胞适应毒感染Vero细胞，同时设未感染阴性对照；感染48 h后弃上清，用冷甲醇固定20 min，PBST洗3次，轻轻拍干；加1∶1 000稀释的单抗腹水，37℃孵育1 h，PBST洗3次，轻轻拍干；加1∶200稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，37℃避光作用50 min，PBST洗3次，轻轻拍干；然后在荧光显微镜下观察，凡有绿色荧光者判为阳性，无荧光者判为阴性。同时设未接毒细胞对照。
1.10 单克隆抗体亚类鉴定
亚类鉴定选用Southern Biotech公司的抗体亚类鉴定试剂盒。根据确定的抗原工作浓度，将WR株纯化抗原溶于包被液中， 4℃放置过夜，PBST洗板3次封闭，分别加入1∶5 000稀释的腹水，37℃孵育1 h后洗板，分别加入1∶8 000 稀释的羊抗鼠 HRP-IgG 亚类二抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM、κappa链和λ链，37℃孵育1 h，洗板3次，避光显色读取吸光值。
1.11 单克隆抗体的Western blot 鉴定
原核表达载体pET-32a表达禽坦布苏病毒E蛋白[19]，SDS-PAGE电泳后通过电转仪转至硝酸纤维素膜上，经洗涤后用5%脱脂乳于4℃过夜进行封闭，PBST洗涤3次，加入上述腹水作为一抗，37℃孵育1 h，二抗用羊抗鼠HRP-IgG，最后用底物进行显色。
2 结果与分析
2.1 抗原的制备与动物免疫
禽坦布苏病毒WR株病毒液浓缩后，通过20%、30%、40%、50%和60%等5个梯度的蔗糖平衡液蔗糖梯度离心3 h后在30%～40%发现有病毒带，收集各带后4℃下离心2 h，弃上清后沉淀用灭菌PBS重悬。纯化病毒乳化后免疫BALB/c小鼠，二免后2周采血检测。
2.2 间接 ELISA 检测方法的建立
根据表1、2可知，抗原的最佳包被浓度为 5 μg·mL-1，血清最佳稀释浓度为 1∶800。
2.3 杂交瘤细胞株的亚克隆及腹水的制备
融合后取细胞培养上清进行间接ELISA检测，随后对这些阳性孔进行亚克隆。克隆前，制备好饲养细胞，经3次以上亚克隆，获得2株稳定分泌抗WR株单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2F6和4E11。将克隆株注入BALB/c小鼠腹腔，所得腹水用间接ELISA检测其效价均为1∶64 000。2.4 间接免疫荧光试验（IFA）
用禽坦布苏病毒WR株细胞适应毒感染Vero细胞，固定后用2F6和4E11株腹水孵育，加入FITC标记的羊抗鼠IgG，最后在荧光显微镜下观察。如图1所示，2F6和4E11株腹水能与WR株感染细胞反应。
2.5 单克隆抗体亚类鉴定
选用Southern Biotech公司的抗体亚类鉴定试剂盒进行亚类鉴定，结果2F6 和4E11 的重链均为 IgG1，轻链均为 кappa 链。
2.6 Western blot 检测
以原核表达载体pET-32a表达的禽坦布苏病毒E蛋白，电泳后转移至硝酸纤维素膜，用5%脱脂奶粉封闭，以禽坦布苏病毒单克隆4E11为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，显色后可见原核表达融合蛋白可与4E11单抗作用（图2）。
3 讨 论
家禽感染坦布苏病毒的报道最早见于2000年 Kono等[20]关于马来西亚肉鸡感染坦布苏病毒病例的描述，受感染的肉鸡表现生长迟缓，并伴有脑炎病变，随后未见相关病例报道。直至2010年春季，我国浙江、福建、山东等地产蛋鸭群中暴发一种以产蛋骤降为特征的新疫病，经研究由坦布苏病毒感染所致，随后陆续出现蛋鸡、鹅、麻雀甚至蚊子感染（或带毒）的报道，其中对鸭的危害程度最甚，主要侵害鸭的生殖系统，致使种（蛋）鸭发热、采食量和产蛋量急剧下降，对我国养鸭业造成了巨大经济损失。因此，对其快速诊断成为重要课题。
目前，国内外研究人员通过原核表达囊膜E蛋白或截短E蛋白作为抗原，其蛋白高级结构可能与实际有所差异，因此制备的单克隆抗体有一定的局限性[12-15]。本研究以全病毒作为免疫原，最大限度保持抗原性和结构一致性，获得的2株杂交瘤细胞株，其分泌的单抗效价可达1∶64 000，并可有效识别禽坦布苏病毒感染的Vero 细胞，通过秋水仙素染色可见杂交瘤细胞的染色体数目比SP2/0细胞多，确定骨髓瘤细胞与B细胞融合成功，为杂合子；原核表达的E囊膜蛋白经SDS-PAGE电泳后进行Western-blot反应，单抗可与原核表达的禽坦苏病毒E蛋白发生反应，表明制备的抗体为禽坦布苏病毒E蛋白抗体，为该病分子流行病学研究及新型诊断试剂研制奠定基础。在本研究中，笔者曾试图用病毒液进行SDS-PAGE电泳后与单抗反应，但反应的条带出现在60 kD处，与E囊膜蛋白的55 kD分子量有所差异，是否是受蛋白电泳的泳動速度影响，还是由于坦布苏病毒多聚蛋白前体的切割所致，仍需进一步研究。
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（责任编辑：张 梅）