【关键词】 白假丝酵母菌;检测技术;基因分型;质谱
中图分类号：R446.5 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.05.017
白假丝酵母菌（candida albicans）俗称白色念珠菌，在一定条件下可侵犯皮肤、黏膜、内脏和血液，引起继发性感染，表现为急性、亚急性或慢性炎症。近年来，医学诊断和治疗技术的迅猛发展，使得各种危重症患者的病死率有所下降，与此同时各种新医疗技术越来越多地被应用，以及免疫缺陷患者增多，人口老龄化日益加剧，条件致病性真菌引发的深部真菌性疾病发生率愈来愈高，严重威胁着患者的身体健康和生命安全，受到医学界的高度重视[1]。对人类致病的深部真菌病原菌主要有假丝酵母菌属、酵母菌属以及曲霉菌属，其中，白假丝酵母菌引起的真菌感染是最常见的一种，有研究表明，在亚洲白假丝酵母菌引起深部真菌病的病死率高达30.0%左右[2]。以往针对白假丝酵母菌传统的分类系统研究方法，如形态学法、生物学法、组织发生学法、血清学法以及药敏谱类型分析等存在区分率较低，易受外环境影响，重复性、精准性较差的缺点，已不能对其进行更深入而有效的分析与研究。目前，随着生命科学及医疗科技的发展，以PCR为基本原理的分子生物学技术以及更高端精准的微生物质谱分析技术已逐步应用于医学研究领域，解决了一些传统检测技术不能解决的问题。现将白假丝酵母菌临床检测及分型技术的研究进展综述如下。
1 白假丝酵母菌检测技术
白假丝酵母菌的基本检测技术包括培养方法和非培养方法，培养方法可分为大培养和小培养两种;非培养方法则包括：显微镜检查、抗原抗体和特异性代谢产物检测、细胞壁成分检测、核酸检测以及质谱分析仪检测。由于非培养方法在灵敏度或特异性上存在一定缺陷，因此其始终不能完全代替培养鉴定方法。
1.1 显微镜直接镜检技术 直接镜检技术是检测白假丝酵母菌感染最基本的检验方法之一，其优点是不需要特殊的设备和试剂，容易开展，即简便、快速而且实用。直接镜检存在的缺点是主观因素导致假阴性或假阳性结果，阴性结果并不能排除白假丝酵母菌感染，阳性率相对较低，且不能直接用于菌种的鉴定[3]。不染色标本直接镜检：对于尿液、脓液及分泌物等标本直接取少量置载玻片上，加适量的生理盐水混匀即可直接镜检，对于皮屑、毛发及指甲等标本，需进行消化处理后，可在显微镜下观察孢子及菌丝体。染色标本显微镜检查：白假丝酵母菌经革兰氏或乳酸棉酚兰染色后，光镜下可见染成深紫色或蓝色的菌丝、孢子，熒光染色更适用于深部感染的白假丝酵母菌检查，在荧光显微镜下观察菌体成黄绿色，目前革兰染色法在临床上使用最为广泛，其不受温度影响，病原体长期固定在涂片上便于复查。
1.2 分离培养鉴定技术 培养基培养鉴定：白假丝酵母菌接种于人或动物血清中孵育后，光镜下孢子可长出细而短的小芽管。CHROMagar显色培养基上白假丝酵母菌呈现翠绿色。培养基培养技术可提高白假丝酵母菌的阳性检出率，同时还可以确定其种类，但培养的时间较长，培养阳性率也较低[4]。检测深部白假丝酵母菌感染的生化试验方法包括：糖类发酵试验、硝酸盐还原试验、尿素酶试验。对于特殊变异的菌株，生化试验鉴定存在一定的局限性。近年来，API 20C AUX等生化鉴定系统不断被开发出来，其正确鉴定率高，鉴定范围宽，但也存在价格昂贵，对无菌操作要求严格的缺点[5]。
1.3 血清学检测技术 目前国外报道检测白假丝酵母菌抗原的试剂普遍存在敏感性和特异性偏低的缺点，朱素梅等[6]研究结果表明该技术操作简便、快速，灵敏度比直接显微镜检测高，适合妇产科门诊大批量标本的筛查。检测特异性抗体及分泌蛋白酶虽然对判断预后和流行病学调查有所帮助，但是对深部白假丝酵母菌感染的确诊意义不大。检测1，3-β-D-葡聚糖是目前比较有发展空间的诊断方法，但对感染的特异性诊断存在局限性，只能作为筛查试验。总之，血清学检测试验存在一定假阴性和假阳性结果，而且检测试剂昂贵，国内尚未广泛使用。
1.4 组织病理学检测技术 通过组织或细胞化学方法在组织切片中找到病原菌-白假丝酵母菌，是确诊该菌感染的金标准[7]。但病理学传统的检测技术敏感性不高，并且存在侵入性操作，有增加感染等并发症的风险，因此不作为诊断白假丝酵母菌感染的首选方法。
1.5 动物接种实验 动物实验应用于白假丝酵母菌实验室诊断的目的是分离出致病菌，确定本菌种的致病性，研究药物对该病原菌的作用等。这种动物实验技术操作复杂繁琐、费时费力，目前只用于科学研究项目，并没有在临床工作中广泛应用。
1.6 核酸杂交检测技术 即用已知特定序列的标记探针与待检测核酸片段杂交，以检验其是否与已知的探针具有同源序列。李田等人[8]用该技术对假丝酵母菌进行检测，证实了核酸杂交的敏感度和特异性均高于传统检测方法，与金标准检测方法具有较好的一致性。
2 白假丝酵母菌基因分型检测技术
基因分型技术是以生物体DNA序列差异为基础建立起来的显示基因组多态性的检测方法。这些分子生物学检测技术具有敏感性高、特异性强、结果稳定可靠等优点，可以作为区分院内多重感染、微生物病原体分型鉴定、种群遗传关系和菌株间亲缘关系等深入研究的技术方法。
2.1 脉冲凝胶电泳核型（PFGE）检测技术 该技术分型能力较强，运用于大分子DNA分离具有良好的重复性和稳定性，适用于流行病学的调查研究[9]，基于PFGE技术的核型分析（EK）技术使得具有大分子量核酸的白假丝酵母菌基因组深入研究得以进行，但此类分型技术耗时长，易受多种因素影响，不能对分子量相近的DNA进行有效分离等[10]。
2.2 多位点酶电泳（MLEE）检测技术 通过检测酶蛋白的多态性来反映基因位点的多态性，是白假丝酵母菌流行病学研究中应用最早的基因分型方法，MLEE具有重复性极佳的优点[11]，但其检测耗时较长，分型分辨率一般，且不能检测全部基因序列，需多个酶切位点结合以提高灵敏度。
2.3 随机引物扩增多态性（RAPD）检测技术 该技术能揭示未知DNA序列基因组多态性的分型方法，拓宽了对基因组DNA变异领域的研究;能区分白假丝酵母菌的感染来源，是目前最常用的基因分型方法。应春妹等[12]认为该方法操作简单快速，灵敏度和特异性较高，被广泛应用于白假丝酵母菌的基因分型中。但该技术检测结果易受实验条件影响，存在重复性较差、难建立标准化的缺点。
2.4 限制性片段长度多态性（RFLP）检测分析技术 凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变和一段DNA的重新组织等均可以导致RFLP的产生。RFLP技术影响因素少，稳定性较高，可进行菌种间和菌种内的基因分型，用于流行病学调查。但其需要相对多的纯基因组DNA，条带分辨率低，不能完全反映出不同菌株间的差异[13]。将RFLP与其他技术（如Southernblot、PCR等）相结合，能完全地反映出不同菌株之间的差异，使分型能力得以提高[14]。
2.5 扩增片段长度多态性（AFLP）检测分析技术 是基于基因组DNA限制性片段上的PCR扩增技术。Tavanti等[15]在应用该技术分析基因型时发现菌株之间存在低变异性。AFLP将RFLP和PCR两种技术有效结合，具有高效分辨率和重复可靠的优点，是一种很好的菌株分型分析方法。但因该技术涉及专利问题，实验成本较高，引物设计及操作技术要求严格，所以其应用和推广受到了限制[16]。
2.6 单链构象多态性（SSCP）检测技术 利用DNA或RNA单链构象多态性的特点，结合PCR进行基因检测的一种分子生物学技术，即PCR-SSCP技术，其分离出的条带具有高特异性，且实验操作简单，成本较低，已成为临床白假丝酵母菌快速分型和微进化检测既有力又经济的分型方法[17]。但该技术对实验各项条件的要求均较高，存在不能准确发现突变位点和类型的缺点。
2.7 DNA测序技术 即分析特定DNA片段的碱基序列。DNA测序方法是目前判断菌株之间同源性最精确的分型方法，它的出现使基因图谱可以构建，极大地推动了生物界和医学界的研究与发展。张志勤[18]对白假丝酵母菌CA6184的全基因组进行测序，阐明了其致病机制，为疾病的治疗奠定了坚实的基础。微卫星长度多态性（MLP）检测技术又称短串联重复序列（STR），是建立在DNA测序原理上发展起来的一种新的分子生物学研究技术。MLP技术具有高分辨率、高通量、自动化的优势，是一种新型有效的分型方法，改进后被广泛应用于白假丝酵母菌的基因分型、亲缘的鉴定、种群遗传结构的分析以及流行病学的研究中[19]。但由于其重复性较低，分析过程复杂且易受实验条件影响，成本较高，因此在研究和应用范围上受限。多位点序列分析（MLST）检测技术是一种建立于核酸序列测定的基因分型方法，近些年发展速度较快，2003年Bougnoux建立了白假丝酵母菌MLST分型的国际标准数据库。Wu等[20]研究证明了MLST是研究白假丝酵母菌流行病学和分子进化的有用工具。MLST研究结果准确，分辨力强，可对大量菌株进行分型，而且实验室间的结果可以进行比对，但存在实验成本高、耗时长的缺点。
3 质谱检测技术
随着新型分子水平技术的发展，质谱（Mass Spectrometry，MS）技术可以对病原微生物（包括病毒、细菌、真菌及孢子、寄生生物等）进行检测和鉴定。与传统的鉴定方法相比，MS技术检测时间短、结果准确、试剂和耗材成本较低，并能准确将假丝酵母菌鉴定到种的水平，为临床对白假丝酵母菌感染的早期、快速诊断提供了新的技术方向[21]。国内李艳君等[22]应用MALDI-TOF质谱仪对酵母菌进行鉴定，结果显示鉴定的总准确率达92.7%，高于VITEK2 Compact鉴定仪和显色培养法。国外Westblade等[23]利用质谱分析技术对白假丝酵母菌进行鉴定，准确率接近100.0%。王庆玲[24]应用MALDI-TOF MS对假丝酵母菌进行鉴定并与显色培养以及ATB Expression鉴定结果比较，在属、种水平上鉴定一致率均超97.0%。以上说明了质谱技术是一种快速、简便、准确、高通量的新型白假丝酵母菌检测鉴定方法，适用于种属的鉴定、大样本流行病学研究等方面，只要深入研究并不断完善数据库资料，质谱分析技术在临床微生物检测及鉴定工作中将会得到广泛的应用。
4 结语
综上所述，医院由于白假丝酵母菌感染引发的疾病呈逐年上升趋势，早期诊断和治疗有助于降低患者的死亡率，挽救更多的生命。目前临床上多采用传统的方法进行检测和鉴定，方法简单实用，具有一定的特异性，但存在敏感性较低、耗时较长的缺点，已经不能满足现代临床对检验报告早期而精准的要求。分子生物学鉴定技术是近几年发展起来的真菌检测的“金标准”，具有较高的灵敏度和特异性，但实验条件要求较高，在常规实验室中的发展受到限制。质谱分析技术是近期应用于临床微生物检验的鉴定方法，在实验室的普及率日趋增高，能将真菌准确地鉴定到种的水平，并能矫正传统鉴定方法的不足与错误，是传统方法的有力补充，有助于耐药机制的研究，但由于人员技术、仪器设备和已知数据库较少等问题，目前尚未广泛投入临床使用。因此，根据临床实验室的具体情况，以及不同类型标本的检测意义，选择适当的鉴定方法是提高诊断速度及准确度的重点所在。随着白假丝酵母菌检测和鉴定技术的不断改进、完善及发展，以及更先进检测技术的研发与应用，将来必定能为临床白假丝酵母菌病的早期特异诊断和治疗提供更宝贵的信息资源。
参 考 文 献
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