【摘 要】目的:探讨精神分裂症断裂基因1(DISC1)与精神分裂症及临床症状的遗传关联。方法:应用病例对照关联研究设计,采用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)方法:分析466例精神分裂症患者和551例正常对照者DISC1基因2个单核苷酸多态性(SNP)位点与精神分裂症的关联。并采用阳性和阴性症状量表(PANSS)评估患者的临床症状,进一步分析PANSS因子分与DISC1多态性的关联。结果:DISC1基因的两个多态性位点rs821597(等位基因A>G,x2 =6.009,P=0.014;基因型:x2 =6.505,P=0.039)和rs821616(等位基因A>T,x2 =7.063,P=0.008;基因型:x2 =6.928,P=0.031)均与精神分裂症显著关联。由上述2个SNPs组成的多个单体型均与精神分裂症关联[如AT(x2 =7.065,P=0.008,OR=1.42,95%CI=1.10~1.83)和GA(x2 =6.009,P=0.014,OR=0.80,95%CI=0.68~0.96)]。上述2个SNPs组成的风险单体型AT间PANSS量表各因子分差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论:DISC1基因多态性与精神分裂症显著关联,但与精神分裂症症状无关联。
【关键词】 精神分裂症;精神分裂症断裂基因1;关联研究
中图分类号:R749.3 文献标识码:A 文章编号:1000-6729(2009)008-0590-05
doi:10.3969/j.issn.1000-6729.2009.08.012
精神分裂症是一种严重的精神障碍,几乎影响到世界1%的人口而且占用了大约2.5%的医疗费用[1]。很多研究表明遗传因素在精神分裂症发病过程中起到很重要的作用[2-4]。越来越多的证据表明精神分裂症断裂基因1(DISC1)在精神分裂症发病中起重要作用[5]。DISC1基因最先是在一个大样本的苏格兰家系研究中发现的,它是1号和11号染色体发生平衡异位(1;11)(q42.1;q14.3)[6]。接下来很多遗传连锁和关联研究进一步支持DISC1基因是精神分裂症和分裂情感性精神障碍的易患基因[7-9]。
目前很多遗传学研究关注风险基因和外在表现之间的关系,比如DISC1基因和精神症状之间的关系[10]。最近国外有几个研究观察了DISC1基因的遗传变异与精神分裂症症状之间的关系。一些研究发现DISC1基因可能与妄想和幻觉有关联[11-13]。DeRosse等人发现包含rs821616(Ser704Cys)和rs821597的DISC1基因单体型与精神分裂症妄想的终生严重程度明显关联[12]。
为了进一步证实DISC1基因和精神分裂症之间的关系,本文分析了中国汉族人群中466例精神分裂症患者和551例正常对照的rs821597和rs821616两位点的单核苷酸多态性(SNPs)。并采用阳性和阴性症状量表(positive and negative syndrome scale,PANSS)[14]评估患者的临床症状,进一步分析PANSS因子分与DISC1基因多态性的关联。
1 对象和方法
1.1 对象
病例组为2000-2007年在北大六院方便取样住院诊治的汉族精神分裂症患者466例,其中,男268例,女198例,平均年龄(30.3±10.2)岁。依据国际疾病分类第10版( ICD-10)精神分裂症的诊断标准,由两名以上精神科医师(其中至少1名是主治医师)独立诊断,诊断一致并排除其他精神科疾病。正常对照者是来自北京市血液中心的献血者,其年龄、性别均与病例组匹配,经非结构式临床访谈排除精神疾病,且家族中无精神疾病及自杀者,个体间无血缘关系。对照组共551例,男303例,女248例,平均年龄(31.5±9.6)岁。
所有研究对象来自中国北方(秦岭-淮河以北)地区汉族人群,均无严重躯体疾病。所有研究对象在入组前详细了解本研究的目的和程序,并签署知情同意书。本研究获得北京大学医学部伦理委员会的批准。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取
抽取所有受试者外周静脉血5 ml,置于EDTA抗凝管中,混匀后保存于4 ℃冰箱,1周内用Qiagen公司的QIAamp DNA 抽提试剂盒提取基因组DNA,- 70 ℃保存待用。
1.2.2 基因型扩增
采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-based restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法,检测所有研究对象的2个SNPs的基因型。其中SNP1(rs821597)位于DISC1基因的第10个内含子,SNP2(rs821616)位于DISC1基因的第11个外显子。SNP2(rs821616)的变异可以引起它所编码的氨基酸发生改变。检测PCR引物、退火温度(Tm)、限制性内切酶等部分信息参见Qu [9]等的报道。两位研究者分别读取基因型结果以保证结果的正确性。同时我们随机抽取5%的样本进行DNA测序,测序结果与PCR-RFLP方法读取的结果完全一致。
聚合酶链反应―限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法。(1)25 μl的PCR扩增反应体系:10 mM Tris-HCl(pH 8.3),50 mM氯化钾,1.5 mM氯化镁,200 μM dNTPs,0.3 μM引物,40 ng基因组DNA,1单位Taq DNA聚合酶。(2)PCR扩增反应条件:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,55 ℃~62 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35个循环,最后72 ℃后延伸7 min。对于SNP1(rs821597)和SNP2(rs821616),分别在15 μl PCR产物中加入3 U限制性内切酶EcoRI和BsrI及2 μl酶切缓冲液,置于37 ℃及65 ℃孵箱过夜消化反应。取10 μl酶切产物,用3 %琼脂糖凝胶电泳分离目的片段,经溴乙锭染色、凝胶成像系统扫描后读取基因型。
1.2.3 临床评定
采用阳性与阴性症状量表(PANSS)[14]评估精神分裂症患者的终生临床症状。参加PANSS量表评定的精神科医师于研究开始前接受培训,2名医师评定一致性Kappa值> 0.85,量表评定在患者入院后1周内完成。最后计算PANSS的5因子分[15],即阳性因子分(妄想、幻觉行为、夸大、猜疑和不寻常思维内容),阴性因子分(情感迟钝、情绪退缩、交流障碍、被动退缩、缺乏自发性和动作迟缓),兴奋因子分(兴奋、敌对性、紧张、不合作和冲动控制障碍),抑郁因子分(焦虑、自罪感和抑郁)和认知损害因子分(抽象思维困难、刻板思维、概念紊乱、定向障碍和注意障碍)。
1.3 统计分析
采用SHEsis遗传分析软件[16]进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验、连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD)、单位点和单体型(haplotype)遗传关联分析,分别比较病例组与对照组各SNPs的基因型和等位基因(卡方检验)以及单体型的频率差异,并对上述遗传分析结果分别采用Bonferroni校正(显著性水平为单位点α值/位点数)和基于100次样本对换的置换检验(resampling-based permutation test),以消除多重假设检验时可能产生的假阳性误差。使用SPSS 软件13.0版本对风险单体型携带者与非风险单体型携带者的PANSS 5因子分进行t检验。
2 结 果
2.1 Hardy-Weinberg遗传平衡检验
2个SNPs位点的基因型频率经Hardy-Weinberg遗传平衡检验,病例组和对照组各多态性位点的观察值和预期值之间差异均无统计学意义(P>0.05),表明该研究对象来自大的群体,个体间为随机婚配,无明显的自然选择、迁移等因素对遗传平衡的影响,资料可靠。
2.2 单位点遗传关联分析
各位点基因型和等位基因的频率分布见表1。SNP1(rs821597)和SNP2(rs821616)的基因型和等位基因的频率在病例组和对照组间差异均有统计学意义。rs821597的等位基因A>G,rs821616 的等位基因A>T,基因型均P<0.05。经Bonferroni校正,上述差异仍有统计学意义。
2.3 连锁不平衡分析及单体型遗传关联分析
为了解各遗传标记位点间的连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD)情况,对2个SNPs位点进行了相邻位点间的LD分析,结果表明D"值为1.0,提示2个SNPs位点之间存在很强的LD。对2个SNPs位点构成的单体型进行分析,结果表明病例组与对照组间AT和GA两个单体型的估计频率差异有统计学意义(见表2)。上述结果经置换检验,P值仍具有统计学意义。
2.4 风险单体型与临床症状的关联分析
对两个位点SNP1(rs821597)和SNP2(rs821616)组成的单体型,分别依据是否携带风险单体型AT,将精神分裂症患者分为两组:DISC1基因风险单体型AT携带组与非风险单体型AT携带组。对两组进行阳性与阴性症状量表评分比较,结果发现两组的各因子得分差异均无统计学意义(见表3)。
3 讨 论
研究发现在中国汉族人群中DISC1基因多态性与精神分裂症存在关联。病例对照研究提示rs821616与rs821597与精神分裂症明显关联。然而,这两个SNPs组成的风险单体型AT与PANSS的阳性、阴性、兴奋、抑郁和认知损害等5个因子并未发现关联。
与本研究结果类似,很多研究支持DISC1基因与精神分裂症关联[7-9]。一些细胞生物学研究提示DISC1与其他一些蛋白如收缩与延伸蛋白ζ-1(FEZ1)、类核分布元件(Nudel)和转录激活因子4/5(ATF4/ATF5)等相互作用从而影响神经发育进程,如神经元迁移、信号转导以及轴突发育等[17]。Callicott等人报道DISC1基因与大脑海马灰质体积减少及执行认知功能时海马异常衔接关联[18]。这些研究提示DISC1基因变异可能会影响到神经认知功能。本研究发现rs821616(Ser704Cys)多态性与精神分裂症关联。rs821616(Ser704Cys)位于DISC1基因的第11个外显子上。这个外显子被认为能够编码与ATF4/ATF5和Nudel相互作用的一种蛋白的某个区域[19]。因此rs821616(Ser704Cys)的非同义突变可能会通过单体型作用或连锁不平衡其他的功能变异来增加精神分裂症的易感性。然而,有些研究并没有能够复制DISC1基因与精神分裂症关联的阳性结果。其中这个基因最初的发现者在以后的一个研究中也没能复制出阳性结果[20]。Kockelkorn等人[21]在日本人群中及Kim等人[22]在韩国人口中均未能发现DISC1基因与精神分裂症之间的阳性关联。本研究进一步验证了DISC1基因是精神分裂症的一个风险基因。
Callicott等人[18]发现DISC1基因中的一个SNP与大脑的海马结构和功能关联,很多研究发现大脑海马功能异常与精神分裂症阳性精神症状的严重性有关联[23-25]。在上面研究的基础之上,DeRosse等人提出假设DISC1基因与精神分裂症阳性症状关联,并且进一步证实了由DISC1基因中rs821616(Ser704Cys)和rs821597两个SNPs组成的单体型与精神分裂症妄想症状终生严重程度关联[12]。Szeszko等人同时也发现DISC1基因与大脑前额叶皮质体积及阳性精神病性症状关联[13]。Hennah等人研究发现DISC1基因的变异与精神分裂症患者的妄想、幻觉及阴性症状关联[11]。
然而本研究并未发现DISC1基因与精神分裂症的临床症状存在关联。这与国外的一些研究结果不一致,可能与以下几个因素有关。(1)病人来自不同的种族人群:DeRosse等人[12]的研究对象是高加索人,而本文对象是中国汉族人。(2)症状评定工具不同:Szeszko等人[13]使用DSM-IV的定式临床晤谈量表(Structured Clinical Interview for Axis I DSM-IV Disorders,SCID)评定精神病人的临床症状。SCID里面包含有14条阳性症状项目,而本文使用的评定工具是阳性与阴性症状量表(PANSS)[14]。在PANSS里面,阳性症状因子分包括妄想、幻觉行为、夸大、猜疑和不寻常思维内容等几项内容[15]。(3)本研究仅分析了两个SNPs位点。
总之,本文的病例对照研究提供了进一步的证据支持DISC1基因是精神分裂症的易患基因。但并没有发现DISC1基因多态性与精神分裂症临床症状之间的阳性关联。本研究结果提示我们尚需进一步寻找生物学证据来探讨风险基因变异对精神分裂症精神病理学的影响。
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编辑:赵志宇
2008-12-22收稿,2009-03-26修回