范东升，张得平，蓝达愉，袁高庆，卢燕回*
1.中国烟草总公司广西壮族自治区公司，南宁市青秀区茶花园路25号 530022 2.广西大学农学院，南宁市西乡塘区大学东路100号 530004
烟草（Nicotiana tabacum L.）是我国主要的经济作物之一，生长过程中常受多种病害的影响，导致烟叶产量与品质下降。按照病害发生部位归类，由主要侵染植株叶片的病原引起的病害统称为叶斑病。烟草叶斑病种类繁多，发生普遍，常见的叶斑病有烟草赤星病、烟草蛙眼病、烟草靶斑病、烟草棒孢霉叶斑病和烟草野火病等［1］。近年来，随着气候环境、耕作制度、栽培条件和栽培品种的改变，不断有新的烟草叶斑病种类或已知烟草叶斑病的新记录病原出现［2-6］。祖燕青等［4］通过形态学和rRNA-ITS序列分析，明确引起河南省烟区烟草赤星病的病原菌种类有链格孢（Alternaria alternata）、长柄链格孢（A.longipes）和鸭梨链格孢（A.yaliinficiens）3种，其中鸭梨链格孢是引起烟草赤星病的首次报道。Sun等［5］通过形态学和rRNA-ITS序列分析将引起贵州烟草靶斑病的病原菌鉴定为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）AG-6，该病原菌是引起烟草靶斑病的新的立枯丝核菌菌丝融合群。Wang等［6］于2017年在贵州正安县发现一种未知的烟草叶斑病，将其命名为烟草斑枯病。该病病斑呈褐色，形状不规则，与健康组织之间有明显的黄色晕圈，发病严重时多个病斑可融合成片，导致整张叶片枯萎，在近3万平方米的发病范围内发病率达30%。随后通过开展病原菌的形态学鉴定、rRNA-ITS和TUB2序列分析，将引起该病害的病原菌鉴定为瓜拟多隔孢（Stagonosporopsis cucurbitacearum），这是烟草斑枯病的首次报道。2021年3月，广西百色市田林县八渡乡局部烟田的K326烟草品种上也出现了一种与烟草斑枯病症状类似的病害，主要危害团棵期烟株的中下部叶片，发病面积约2 000 m2，田间病株率约8%。为明确该病害的病原，于发病烟田采集不同病株上的典型发病叶片，通过组织分离法进行病原菌的分离，按照柯赫氏法则验证病原菌的致病性，将病原菌的形态鉴定和分子鉴定相结合，确定病原菌的分类地位，以期为该病害的科学防控提供参考。
1.1 供试材料
用于病原菌分离的烟草病叶标样采集于广西百色市田林县八渡乡发病烟田的病株，置于封口袋中，保存在4℃冰箱中备用。健康烟草植株来自广西大学农学院温室，品种为K326，用于分离菌株的致病性测定。
1.2 病害症状观察与病原菌的分离纯化
观察广西百色市田林县八渡乡烟田病害发生的烟草生育期、危害部位、病斑形状和颜色、病斑大小、病斑上有无病征等症状特点，并与已知烟草病害症状进行对比。
采集病叶，采用常规组织分离法［7］分离病原菌，具体步骤为：剪取病健交界处叶片组织并用75%（体积分数）酒精表面消毒30 s，再用0.1%（质量分数）氯化汞溶液消毒30 s，无菌水冲洗3次。用无菌剪刀将消毒后的病叶组织块剪成5 mm×5 mm的小块，移到马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，置于28℃恒温培养箱培养2～3 d，待菌丝长出后，在无菌条件下用接种针挑取菌落边缘的菌丝块，转移至新的PDA培养基上进行纯化培养5 d，再用PDA斜面试管培养7 d后置于4℃冰箱中保存备用。
1.3 分离菌株的致病性测定
将保存的代表性菌株转移至PDA平板上，在28℃恒温培养箱中培养5 d，按照柯赫氏法则对分离菌株的致病性进行测定［8］。采用菌丝块接种法［9］对健康烟草叶片进行有伤和无伤接种。选取5～6叶期烟株中下部叶片，叶片左半边的接种部位用无菌针头刺3个小孔，右半边无伤处理。用打孔器取直径为5 mm的菌丝块，将菌丝面朝下贴于叶片上，每张叶片接种4个菌丝块，然后在菌丝块上覆盖无菌水湿润后的棉花薄层，并套袋保湿。每个处理接种3张叶片，重复3次。对照组接种PDA培养基块。将接种后的烟株置于28℃光照培养箱中，观察并记录发病情况。待叶片发病后，从发病部位再次分离菌株进行鉴定，以完成柯赫氏法则验证。
1.4 病原菌的形态特征观察
在28℃和12 h光照/12 h黑暗条件下将菌株分别在PDA和V8培养基中培养，观察菌落形态。待形成子实体后，在尼康Eclipse 80i显微镜（日本株式会社尼康公司）下镜检子实体和分生孢子形态特征，并随机挑选30个子实体和50个分生孢子测量其大小。
1.5 病原菌的rRNA-ITS和TUB2序列分析
将纯化后的菌株按照真菌基因组DNA提取试剂盒（杭州博日科技股份有限公司）说明书的方法提取基因组DNA。使用通用引物组ITS1/ITS4、Bt2a/Bt2b分别扩增ITS、TUB2序列［10］。PCR扩增体系（25μL）：Taq PCR MasterMix 12.5μL，上下游引物各1μL，模板DNA 1μL，用ddH2O将反应体系补至25μL。PCR反应程序：94℃预变性4 min；
94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸60 s，30个循环；
72℃延伸10 min，4℃保存。取5μL PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，观察到单一条带后，委托上海生物工程股份有限公司对扩增产物进行测序。使用NCBI网站的Blastn在线工具对序列进行比对分析，在GenBank数据库中下载Aveskamp等［11］提供的参考菌株基因序列，与本研究中菌株的序列比对剪切后按ITS-TUB2的顺序进行拼接，利用MEGA 6.0软件以邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树。
2.1 病害症状描述及病原菌的分离纯化
经田间观察，于广西百色市田林县新发现的烟草叶斑病主要危害团棵期的中下部烟叶，发病初期时叶片上呈现褐色小斑点且黄晕明显，然后扩展形成椭圆形或不规则形病斑，大小不一，病斑边缘深褐色，病健交界清晰，多个病斑可融合成片，导致叶片枯黄脱落（图1A、图1B）。该病症状与Wang等［6］报道的烟草斑枯病症状相似。从典型发病烟叶的病健交界处分离获得多株菌落特征一致的菌株，经纯化培养后，选取代表性菌株NL-2-1进行后续致病性测定和鉴定。
2.2 病原菌的致病性测定
按照柯赫氏法则测定代表性菌株NL-2-1的致病性。结果显示，接种健康烟草叶片3 d后，接种部位边缘呈黄色病变，且从有伤接种处开始变褐，病斑逐渐扩展，7 d后发病部位严重变褐坏死，病健交界处有明显黄晕，有伤接种病斑扩展更快（图1C），空白对照叶片未发病（图1D）。
图1 烟草斑枯病症状及菌株NL-2-1的致病性测定Fig.1 Symptoms of tobacco spot blight and pathogenicity determination of strain NL-2-1
从接种发病的烟叶中再分离得到的病菌与田间发病烟叶中分离的菌株NL-2-1形态一致，证明菌株NL-2-1对烟草叶片具有致病性，是引起广西烟草斑枯病的病原菌。
2.3 病原菌的形态特征
菌株NL-2-1在PDA培养基中气生菌丝不发达，菌落初期呈白色，随着培养时间的延长逐渐变为灰白色，未见产孢（图2A）。在V8培养基中培养约10 d能形成小黑点，为该菌株形成的分生孢子器。分生孢子器近球形，直径70～150μm，多埋生，在培养基中集中生长，形成约45°的扇形产孢区域（图2B、图2C）。挤压小黑点镜检，能观察到大量的分生孢子。分生孢子单胞，无色，呈椭圆形，大小为4.8～12.3μm×2.1～3.8μm（平均大小为7.1μm×2.7μm）（图2D），与Bracale等［12］描述的Stagonosporopsis属形态特征相近。
图2 菌株NL-2-1的形态特征Fig.2 Morphological characteristics of strain NL-2-1
2.4 病原菌的rRNA-ITS和TUB2序列分析
经测序，菌株NL-2-1的rRNA-ITS和TUB2序列分别为536 bp（NCBI登录号为OM062578）和336 bp（NCBI登录号为OM240593）。Blastn比对结果显示，其与Stagonosporopsis caricae的相似度分别为99.61%（ITS，MH860977）和100%（TUB，MK255067）。选取Aveskamp等［11］提供的相关菌株Stagonosporopsis caricae，S.cucurbitacearum，S.heliopsidis，S.andigena，S.dorenboschii的rRNA-ITS和TUB2序列联合建立系统发育树进行系统发育分析。结果显示，菌株NL-2-1与Stagonosporopsis caricae亲缘关系最近，以100%的自展支持率聚为同一个分支（图3）。结合形态学特征及分子鉴定结果，确定引起广西烟草斑枯病的病原菌为Stagonosporopsis caricae。
图3 菌株NL-2-1的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain NL-2-1
根据病原菌的致病性测定、形态特征观察、rRNA-ITS和TUB2序列分析结果，明确了广西烟草斑枯病的病原菌为Stagonosporopsis caricae，这是该病原菌在烟草上发生危害的首次报道。Stagonosporopsis属之前被归属于壳二孢属Ascochyta，因其偶尔形成多隔分生孢子（Stagonospora-like）而被划分为新属，与茎点霉属Phoma亲缘关系相近，所以Stagonosporopsis caricae也曾命名为Ascochyta caricae-papayae Tarr.和Phoma caricae-papayae（Tarr.）Punith.［13］。2010年，Aveskamp等［11］根据LSU（28S large subunit of the nrDNA）、rRNA-ITS和TUB2（beta-tubulin 2 gene）多基因序列分析，研究了茎点霉属Phoma和格孢腔菌目Pleosporales内相关属的遗传进化关系，并将该病原菌重新命名为Stagonosporopsis caricae（Sydow & P.Sydow）Aveskamp，Gruyter & Verkley。2021年，何苏琴等［14］将Stagonosporopsis caricae的中文名命名为木瓜拟多隔孢，该病原菌可引起番木瓜（Carica papaya）茎干腐烂。
Stagonosporopsis caricae除了是侵染番木瓜科（Caricaceae）作物的重要病原菌，与另外两个近缘种S.cucurbitacearum和S.citrulli一样还可引起西瓜（Citrullus lanatus）、黄 瓜（Cucumis sativus）、甜 瓜（Cucumis melo）、南瓜（Cucurbita moschata）和苦瓜（Momordica charantia）等多种葫芦科（Cucurbitaceae）作物的蔓枯病和叶疫病［15-17］。发生在贵州的烟草斑枯病的病原菌为S.cucurbitacearum，本研究中鉴定出引起广西烟草斑枯病的病原菌为S.caricae，进一步丰富了该病原菌的寄主范围和烟草斑枯病的病原菌种类。目前该病害在广西田林县烟区局部田块轻度发生，后期通过喷施广谱杀菌剂控制了病情的扩展。后续应持续关注该病害的危害程度、分布范围和发病规律，以避免其对当地烟叶生产造成不利影响。
明确了广西烟草新记录病害为烟草斑枯病，该病在烟草团棵期即可危害中下部烟叶，导致叶片提前枯黄脱落。通过致病性测定、形态学观察、rRNA-ITS与TUB2基因序列联合系统发育树分析，鉴定出引起广西烟草斑枯病的病原菌为木瓜拟多隔孢（Stagonosporopsis caricae），是该病原菌在烟草上发生危害的首次报道，且木瓜拟多隔孢与贵州报道的烟草斑枯病病原菌同属不同种，表明将rRNA-ITS和TUB2基因序列联合分析，可有效区分Stagonosporopsis属的不同种类。
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