张蒙蒙， 梁俊阳， 王清福， 都亚飞， 张洁，刘前进， 彭建斐， 付博
(1.河南农业大学烟草学院，河南 郑州 450002；
2.河南中烟工业有限责任公司技术中心，河南 郑州 450016；
3.湖南省烟草公司怀化市公司, 湖南 怀化市 418000；
4.河南省农业科学院植物保护研究所，河南 郑州 450002)
烟草黑胫病是由烟草寄生疫霉(Phytophthoranicotianae)引起的一种土传性病害，又叫做“黑根病”“黑秆疯”[1]。该病害遍布中国的各大烟区，年均经济损失达1亿元以上[2]，是烟草农业生产上的毁灭性病害之一[3]，生产上需要一种安全有效的防控方法[4]。化学药剂是防治烟草黑胫病的的常用手段，但长期大量施用化学药剂易产生抗药性、对环境以及人体健康造成严重危害[5-6]。随着人们对烟叶安全性和生态安全的日益关注，烟草黑胫病的生物防治(以下简称“生防”)越发重要，逐步成为烟草病害绿色防控的重要措施之一[7-8]。
生防细菌具有生活周期短、繁殖力高、代谢产物丰富、对病原菌作用方式多样、易于定殖等特点，是尤其重要的一类植物病害生防资源[9]。目前，已经有一部分生防细菌应用于烟草黑胫病的生物防治中。罗玉英等[10]从烟草根际土壤中筛选到了对烟草疫霉有明显拮抗能力的2株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)和1株枯草芽孢杆菌菌(Bacillussubtilis)，3株生防菌灌根处理对烟草黑胫病的田间防效分别达到70.1%、63.5%和60.2%。尹坚等[11]对湖南烟区黑胫病重发田根际土壤样品进行富集培养，筛选出195个对烟草黑胫病有拮抗效果的细菌菌群，其中B44R菌群对烟草黑胫病的田间防效达到51.56%。何明川等[12]从昆虫肠道中分离到对烟草疫霉具有有较好拮抗效果的枯草芽孢杆菌MC4-2菌株，通过对峙试验发现该菌对烟草疫霉菌丝的抑制率可达到64.04%。张幸博等[13]通过平板对峙试验从烟草根际土壤中筛选到的烟草节杆菌(Arthrobacternicotianae)LG-3菌株，对烟草苗期黑胫病的防效达85.59%。前人的试验结果表明，拮抗细菌对烟草黑胫病具有较好的应用潜力，但是目前被开发成商品制剂的菌株较少，只有枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等被开发成产品并运用到烟草黑胫病的防治中，大大限制了生防菌的应用和推广。为创新烟草黑胫病的生防资源，本试验对前期分离到的2株生防菌进行种类鉴定和防治效果测定，以期为烟草黑胫病的绿色防控奠定基础。
1.1 试验材料
供试菌株：供试生防细菌为YCYM-04、YCYM-09，由河南农业大学烟草工程实验室从湖南怀化烟草黑胫病病株根际土壤中分离、筛选获得；
烟草黑胫病病原菌烟草疫霉(Phytophthoranicotianae)由河南农业大学烟草工程实验室分离和保存。
供试培养基：PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，蒸馏水定容至1 L，分装121 ℃灭菌20 min；
NA培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂18 g, 蒸馏水定容至1 L，分装121 ℃灭菌20 min。
NB培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸馏水定容至1 L，分装121 ℃灭菌20 min。
小米培养基：小米煮熟晾干，装入三角瓶中高压灭菌30 min。
1.2 试验方法
1.2.1 生防菌株的鉴定 挑取YCYM-04和YCYM-09菌株单菌落在NA培养基上画线，30 ℃培养16～48 h，观察菌落特征并进行革兰氏染色和扫描电镜观察，观察其菌体大小、形状、有无芽生孢子。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》[14]对2株菌株进行生理生化特征测定。利用CTAB法提取YCYM-04和YCYM-09菌株的基因组DNA，采用细菌16 S通用引物27-F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)/1492-R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增其序列。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后克隆测序，将测序所得的序列与NCBI数据库进行Blast对比分析，并运用CLUSTAL X软件进行多序列比对和系统进化分析软件MEGA 6.0当中的Neighbor-Joining算法构建系统发育树。
1.2.2 生防菌株对烟草疫霉的抑制效果测定 将烟草疫霉在PDA培养基上活化5 d后，取烟草疫霉菌饼(直径为5 mm)倒置接种于PDA平板中央，分别挑取YCYM-04和YCYM-09菌株单菌落对称两点接在距离菌饼2.5 cm处，以只接烟草疫霉的平板作为对照，3次重复，倒置于28 ℃培养箱中培养7 d后，测算抑菌带大小，即真菌边缘与细菌中心点之间的距离。
测定YCYM-04和YCYM-09菌株发酵滤液对烟草疫霉的抑菌活性。分别挑取生防细菌的单菌落接种于100 mL的NB培养基，30 ℃、180 r·min-1振荡培养48 h得培养液，将培养液8 000 r·min-1室温离心5 min，取上清液用0.22 μm滤膜滤除菌体，得到发酵滤液。将滤液与PDA培养基分别按V(滤液)∶V(培养基)=1∶4、1∶9和1∶99混合均匀制成平板，取直径为5 mm的烟草疫霉饼接种于平板中央，以加无菌水的PDA平板为对照，每处理3个重复，培养7 d后用十字交叉法测量菌落直径，计算菌落生长抑制率，同时显微观察YCYM-04和YCYM-09发酵液对烟草疫霉菌丝形态结构的影响。菌落生长抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直接)/对照菌落直径×100%。
1.2.3 生防菌株对烟草疫霉的室内防治效果 分别挑取YCYM-04和YCYM-09的单菌落接种于100 mL的NB培养基，30 ℃、180 r·min-1振荡培养至OD600为0.8～1.0，得生防细菌培养液。将活化好的烟草疫霉打成菌饼，每100 mL小米培养基接种4块，于25 ℃培养20 d得烟草疫霉小米培养物。将m(土)∶m(草炭)=3∶1的比例混合均匀，在烘箱内160 ℃灭菌2 h得无菌基质。取长势一致的5～6片真叶烟苗移栽于无菌基质中，缓苗3 d后，将YCYM-04和YCYM-09培养液20 mL·株-1灌根处理，每3 d灌根1次，共灌根3次，第3次灌根24 h后接种烟草疫霉，用刀片在烟苗茎基部划3 mm伤口，然后接种烟草疫霉小米培养物(3 g·株-1)，接种后立即覆土保湿，在25 ℃，12 h光照与12 h黑暗交替条件下培养。以等量无菌的NB培养基作为空白对照，另设40%三乙膦酸铝灌根处理作为药剂对照，缓苗3 d后每株烟苗1 g·株-1灌根处理，间隔10 d再灌根1次，共灌根2次，每处理10株烟苗，3次重复。接种20 d后调查发病情况，烟草黑胫病分级标准参照中华人民共和国国家标准(GB/T 23222—2008)，计算病情指数和防治效果。病情指数=100×∑(各病情分级×该病级的发病株数)/分级标准中最高级别数×调查总株数，防治效果=(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100%。
2.1 生防菌株的分类鉴定
YCYM-04菌株在NA培养基上培养48 h后，菌落呈淡黄绿色且不透明，表面光滑，边缘规则，有黏性；
革兰氏染色阴性，菌体呈短杆状，大小为2.58 μm×0.28 μm(图1)。生理生化测定结果显示，YCYM-04菌株能够产生过氧化氢酶和蛋白酶、水解吐温80、液化明胶、胨化牛奶、还原硝酸盐，并且能利用葡萄糖、麦芽糖、乳糖、木糖、甘露糖和蔗糖(表1)。将YCYM-04菌株的16 S rDNA序列与NCBI数据库比对分析，结果显示，YCYM-04与嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)的相似性最高。系统发育树结果也显示，YCYM-04菌株与嗜麦芽寡养单胞菌(S.maltophilia)处于同一分支(图2)，结合该菌株的形态学和生理生化特征，将YCYM-04菌株鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌(S.maltophilia)。
注：A,菌落；
B,革兰氏染色特征；
C,菌体。
图2 YCYM-04菌株基于16S rDNA基因序列的系统发育树
表1 YCYM-04菌株的生理生化特征
YCYM-09菌株在NA培养基上培养16 h后，菌落乳白色且不透明、表面粗糙、边缘不规则，革兰氏染色阳性，菌体呈短杆状，大小为3.26 μm×0.63 μm(图3)。生理生化测定结果显示，YCYM-09菌株能够液化明胶、水解淀粉,利用柠檬酸盐，并且能利用葡萄糖、麦芽糖、乳糖、木糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇(表2)。将YCYM-09菌株的16S rDNA序列与NCBI数据库比对分析，结果显示，YCYM-09菌株与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)相似性最高。系统发育树结果也显示，YCYM-09菌株与贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)亲缘关系最近(图4)，结合该菌株的形态学和生理生化特征，将YCYM-09菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)。
表2 YCYM-09菌株的生理生化特征
注：A，菌落；
B，革兰氏染色特征；
C，菌体。
图4 YCYM-09菌株基于16S rDNA基因序列的系统发育树
2.2 生防菌株对烟草疫霉的抑制效果测定
对峙培养结果显示，YCYM-04菌株和YCYM-09菌株与烟草疫霉对峙培养7 d后，抑菌带分别达13.7和8.9 mm(图5-B、C)。另外，不同稀释倍数的YCYM-04菌株和YCYM-09菌株发酵滤液在PDA平板中对烟草疫霉的菌丝生长均有明显的抑制作用，其中YCYM-04菌株5倍稀释液的菌落抑制率达到71.8%，10倍稀释液的菌落抑制率为63.5%，100倍稀释液的菌落抑制率为34.1%(图5-G)。YCYM-09菌株的对烟草疫霉的菌落抑制率分别为：5倍稀释液50.6%，10倍稀释液36.5%，100倍稀释液22.4%(图5-H)。
利用显微镜观察YCYM-04菌株和YCYM-09菌株发酵滤液对烟草疫霉菌丝形态的影响，与YCYM-04菌株对峙培养后，烟草疫霉菌丝节间缩短、断裂、生长缓慢(图5-E)，与YCYM-09菌株对峙培养后，烟草疫霉菌丝体膨大增粗、畸形、原生质体凝结等现象(图5-F)，而对照菌丝表面光滑、粗细均匀、生长点正常(图5-D)。
注：A,烟草疫霉菌落对照；
B、C,YCYM-04菌株和YCYM-09菌株与烟草疫霉的对峙培养；
D,对照平板上的烟草疫霉菌丝；
E、F,YCYM-04菌株和YCYM-09菌株对烟草疫霉菌丝形态的影响；
G、H,不同稀释倍数的YCYM-04和YCYM-09发酵滤液对烟草疫霉生长的影响。
2.3 生防菌株对烟草疫霉的盆栽防效测定
室内盆栽结果(表3)可以看出，与对照相比，YCYM-04和YCYM-09菌株灌根处理均能显著降低烟草黑胫病的病情指数，防治效果分别达50.5%和61.5%。其中YCYM-09菌株灌根处理的病情指数为23.3，化学药剂三乙膦酸铝灌根处理的病情指数为19.7，二者没有显著性差异，此外，YCYM-04菌株灌根处理也接近三乙膦酸铝灌根处理的防治效果。由此可见，YCYM-04菌株和YCYM-09菌株在烟草黑胫病的防治中具有潜在的应用价值。
表3 生防细菌对烟草黑胫病的室内防治效果
随着人们对烟叶安全性的日益关注以及农业可持续发展战略的提出，生物防治成为实现绿色防治烟草病害的重要措施[15]。为创新烟草黑胫病的生防资源，本研究对前期从烟草黑胫病病株根际土壤中分离的YCYM-04和YCYM-09菌株进行种类鉴定，将其分别鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，并进行防效测定，丰富了烟草黑胫病的生防菌库。
嗜麦芽寡养单胞菌是一类重要的根际促生菌，目前已被应用于小麦赤霉病[16]、棉花黄萎菌[17]、马铃薯青枯病[18]、草莓炭疽病[19]等多种植物真菌病害的生物防治中，但是目前鲜有利用嗜麦芽寡养单孢菌防治烟草黑胫病的报道。JIN等[20]利用平板对峙法从烟草根际土壤样品分离到一株对烟草疫霉具有拮抗作用的嗜麦芽寡养单胞菌，但其没有进一步研究该菌株在土壤中对烟草黑胫病的防治效果。有研究表明，离体条件下生防菌抑制病原菌的能力与其在活体上抑制病原菌所致病害的能力可能存在一定差异[21]，外源生防菌株在活体或环境中有效定殖才能稳定发挥作用效果[22]。本研究中，嗜麦芽寡养单胞菌YCYM-04菌株不仅在离体条件下具有较强的抑菌作用，细菌培养液灌根处理对烟草黑胫病的室内防治效果也达50.5%。说明该菌株能够在土壤中定植并发挥防效，具有一定的生防潜力。
贝莱斯芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)亲缘性很高的细菌[23]，其中枯草芽孢杆菌和解淀粉芽胞杆菌已被广泛用于烟草黑胫病的生物防治中[24-25]，但是目前利用贝莱斯芽孢杆菌防治烟草黑胫病的报道较少。李苗苗等[26]报道,将贝莱斯芽孢杆菌GY1与解淀粉芽孢杆菌GY10和枯草芽孢杆菌GY12进行复配能够提高对烟草黑胫病的防治效果。而本研究中贝莱斯芽孢杆菌YCYM-09菌株灌根处理对烟草黑胫病的室内防效与化学药剂三乙膦酸铝灌根处理的防效无显著性差异，说明贝莱斯芽孢杆菌YCYM-09菌株具有较好的开发利用潜力。
植物病害的生防细菌通过产生抑菌物质、诱导植物抗性、种群竞争等多种方式发挥生防效果[27]。学者发现，嗜麦芽寡养单胞菌不仅能产生多种抑菌活性物质，如几丁质酶、蛋白酶、脂酶和葡聚糖[28]，还能分泌抗菌素类次生代谢产物如Xanthobaccin及Maltophilin[29-30]。芽孢杆菌也能够产生多种抑菌蛋白和脂肽类抗生素[31]，并能促进作物生长并诱导植株系统抗性[32-33]。但目前尚未有嗜麦芽寡养单胞菌和贝莱斯芽孢杆菌对烟草疫霉作用机制研究的报道。本研究发现，YCYM-04和YCYM-09发酵液对烟草疫霉具有较强的抑制作用，使烟草疫霉菌丝形态发生明显变化，YCYM-04造成烟草疫霉菌丝节间缩短、断裂、生长缓慢， YCYM-09造成烟草疫霉菌丝体膨大增粗、畸形、原生质体凝结。今后尚需对YCYM-04和YCYM-09菌株产生的抑菌物质成分进行深入研究。
室内抑菌测定结果显示，嗜麦芽寡养单胞菌YCYM-04菌株及其发酵液的抑菌能力优于贝莱斯芽孢杆菌YCYM-09菌株，而盆栽试验中贝莱斯芽孢杆菌YCYM-09灌根处理对烟草黑胫病的防治效果高于嗜麦芽寡养单胞菌YCYM-04菌株，推测其可能与芽孢杆菌具有较强的定殖能力及环境适应能力有关。下一步将验证这两株生防菌株对烟草黑胫病的田间防治效果，以期为烟草黑胫病的绿色防治提供依据。
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