基因敲除猪终获成功加速异种器官移植


打开文本图片集

潘登科,中国农业科学院北京畜牧兽医研究所副研究员、博士,主要从事猪体细胞克隆、转基因及胚胎干细胞研究,在转基因体细胞克隆猪和体细胞基因敲除猪等研究方面取得了一批国内外领先成果。2010年获得我国首例敲除α1,3半乳糖苷转移酶(α1,3GT)基因的器官移植猪7头,为创建抗超急性免疫排斥反应的器官移植猪迈出了关键的一步。2010年获得敲除肌肉生长抑制素MSTN基因的双肌猪31头,建立了高效的体细胞基因敲除克隆猪技术平台,为研究该基因的功能奠定了基础。获2008年“神农中华农业科技奖”一等奖(体细胞克隆猪和转基因体细胞克隆猪技术平台的建立与应用,排名第6)、2010年国家科技进步二等奖(牛和猪体细胞克隆研究及应用,排名第9)。

随着人体器官移植技术的日趋成熟,器官供体短缺成为阻碍人们追求健康的最大因素。如何解决器官供体不足的难题,已经成为全社会普遍关注的问题。

2010年11月,中国农业科学院北京畜牧兽医研究所成功研制出的4头敲除α1,3半乳糖苷转移酶(α1,3GT)单等位基因的近交系五指山小型猪,为我国创建抗超急性排斥反应的器官移植猪迈出了关键的一步,有助于加速我国异种器官移植研究。该项目负责人潘登科副研究员介绍:“这是我国第一例敲除超急性免疫排斥基因的异种器官移植猪,已经通过中国农业大学农业生物技术国家重点实验室的分子鉴定。它的成功研制,使我国成为世界上少数几个获得成功的国家之一。”

攻坚克难 服务于人

“所谓克隆,就是一种无性繁殖,简单说就是借助卵子将一个体细胞变成一个胚胎,经过卵子重新程序化,最终生产出个体。”潘登科介绍,不同动物有不同的生理特征,在胚胎构建、胚胎培养和移植等方面都有差异,因此不同动物的克隆技术也存在很大的区别。与牛羊相比,克隆猪的卵子成熟质量更差,体外操作更难把握,成功难度也更大。

克隆猪研究最大的应用是异种器官移植,除了可作为众所周知的器官水平上的重要脏器的移植供体,还能够实施细胞的移植,比如已有猴子实验证明的胰岛细胞移植可治疗糖尿病。此外,克隆猪研究还是转基因疾病模型的建立和转基因猪育种等研究工作的基础。

潘登科介绍,这次实验使用的近交系五指山小型猪是我国自主培育的,它在解剖、生理结构、代谢机制、器官发育等多方面与人更为相近,是人类异种器官移植的理想供体。而近交系猪具有基因高度纯合、遗传性状稳定、表型均一和遗传背景清楚等优点,有助于推动异种器官移植临床前实验研究。目前国内有不少实验室在克隆猪领域开展工作,现在已有七八个实验室能做出克隆猪,但能做出基因敲除猪的只有三个实验室。

做基因敲除猪最大的难题就是如何做好体细胞基因打靶。“体细胞基因打靶的效率非常低,只有百万分之一甚至千万分之一。”潘登科在提到细胞筛选工作时说,“筛选半年拿到了2000个克隆点,但鉴定后才发现只有几个是阳性的,这个工作量是很大的。”为解决这一难题,潘登科团队在核移植胚胎干细胞(ntES细胞)的分离和培养方面开始了探索,利用ES细胞进行基因打靶可大大提高转基因的效率,进而提高生产转基因猪的效率。

猪器官移植给人要解决的关键技术是超急性免疫排斥反应,而猪体内的α1,3半乳糖苷转移酶基因所产生的α1,3半乳糖表位是引起超急性免疫排斥的主要因素,潘登科团队采用体细胞基因敲除和克隆技术,敲除α1,3半乳糖苷转移酶基因,为最终获得抗超急性免疫排斥的体细胞克隆猪奠定了基础。

下一步,他们的目标是用至多两年的时间,解决其他排斥反应,同时也会做一些临床前的研究工作。所谓临床前研究,就是先将器官移植到与人很接近的猴子身上进行研究实验,解决排斥反应、临床疾病等各种可能存在的问题,最终为人的临床应用奠定基础。但潘登科说,要真正用到人的身上,还不能着急,要做实,将风险降到最低,更好地服务于人。

两次成果 轰动全国

2005年7月,潘登科博士毕业来到现在的单位—中国农业科学院北京畜牧兽医研究所基因与细胞工程室,进行猪转基因克隆和胚胎干细胞研究。几年间,他取得了诸多的成绩:他对猪体细胞核移植技术体系进行了进一步的优化,在卵母细胞体外成熟液中添加促减数分裂甾醇(MAS),提高了卵母细胞成熟的质量;在胚胎重新程序化上,他利用TSA(去乙酰化抑制剂)处理早期胚胎,提高了克隆胚胎的囊胚发育率;在核移植供体细胞类型方面,他探索利用五指山小型猪胎儿成纤维细胞、新生猪骨髓间充质细胞和成年猪前脂肪细胞三种类型的体细胞为核供体,生产体细胞克隆胚胎和转绿色荧光蛋白基因的体细胞克隆胚胎。

在基因敲除猪成功之前,潘登科和他的团队已经两次轰动中国克隆界。

第一次是2005年,当时的潘登科还在农业生物技术国家重点实验室进行博士课题研究。在导师吴常信院士和李宁院士的指导下,潘登科和当时的同学张运海博士共同合作,成功获得了我国首例体细胞克隆猪,首次在国内报道了利用体细胞核移植技术生产猪转基因囊胚;首次在国际上报道了不同氧分压环境下成熟培养的猪卵母细胞支持克隆胚胎早期发育的能力相似;在世界上首次尝试利用4℃冷藏的猪胎儿成纤维细胞为供体开展转基因克隆胚胎生产。

另一次是2008年北京奥运会期间,由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、军事医学科学院生物工程研究所和河北省玉田种猪场(玉田县牧富种猪繁育有限公司)共同合作,培育出我国首批转“ω-3”脂肪酸去饱和酶基因的克隆猪,脂肪酸检测发现肌肉中ω-3多不饱和脂肪酸提高了13倍多。这种转基因猪体内富含的ω-3多不饱和脂肪酸,是深海鱼油的主要成分,能够维持体内脂肪酸平衡,调节血脂,降低血胆固醇,预防冠心病、高血压、脑中风等心脑血管疾病。这项研究的成功,是我国转基因克隆猪制备上取得的重要进展,为转基因猪新品种培育奠定了重要基础,使我国成为继美国之后第一个培育出富含“鱼油”转基因克隆猪的国家。

基因敲除猪项目是潘登科团队2009年开始研究的,靠自身一步步摸索,在不断的失败中慢慢摸索,最终取得成功。这项研究也得到了军事医学科学院生物工程研究所陈红星研究员、南方医科大学基因工程研究所、甘肃农业大学动物科技学院、北京市畜牧兽医总站和北京安定种猪场等的协助。

精诚协作 风雨向前

潘登科自小喜欢安静,喜欢做研究,做事喜欢较真。不管是硕士期间的技术启蒙人、中国科学院动物研究所首席科学家陈大元研究员,还是给自己奠定做大做强基础的博士导师李宁院士,抑或是曾经的师兄师姐、现在的研究团队,潘登科都心存感激。潘登科说,自己从他们身上学到了很多优秀的品质,懂得了什么是做科研、什么是团队协作、什么叫榜样的力量……

潘登科说自己能取得今天的成绩,离不开同行的帮助和团队的努力。“我们有克隆技术的保障,有军事医学科学院生物工程研究所陈红星研究员在基因工程方面的丰富经验,我们是在多方坚实基础之上进行的综合研究。怎样构建好一个打靶的载体,如何做好细胞筛选……”潘登科团队通过无数次的实验解决细胞不纯、细胞老化等问题,一点点向前推进,逐渐摸索出了自己的研究思路和研究方法,最终取得成果,并达到国际先进水平。

“谁都想为社会做出漂亮的工作,在基因敲除猪这方面,我们觉得很有自信!”潘登科提到自己和团队的研究工作时不无自豪地说,“刚开始的时候,大家都觉得是天方夜谭,可我们经过努力做出来了。目前在世界上我们的技术也是非常棒的,而且我们做的工作很有分量,是贴合国际发展潮流、满足国家战略发展需要的。”

现在潘登科的动物克隆和转基因研究组共有7个研究人员,个个都是有着过硬技术的好手,精诚协作的精神使具有不同专长的他们,能够在研究的过程中获得最大化的效能。他们始终本着对科研高度负责的态度,以高效生产具有重要研究和应用价值的转基因动物为自己的最终目标。

2010年,潘登科团队又获得了敲除肌肉生长抑制素MSTN基因猪31头,为研究该基因的功能奠定了基础。

潘登科介绍,现在和未来的一段时间,实验室将充分利用自身优势—克隆技术平台、转基因技术平台和细胞筛选平台,并调配精力到转基因猪遗传分析和功能鉴定方面。“拿到转基因猪以后,我们需要对基因的功能、表型等从分子水平、蛋白水平等做一系列的鉴定,确定转基因猪的应用价值。”接下来,他们还打算将现在比较强调克隆和转基因技术研究的实验室,打造成更加全面、具备更系统研究功能和评价体系的平台。

现在,敲除α1,3半乳糖苷转移酶基因的体细胞克隆猪和敲除肌肉生长抑制素MSTN基因猪即将进入扩繁和功能评价研究。任重道远,未来等待潘登科及其研究团队完成的任务还很多。