摘要：目的 观察健脾活骨方不同提取部位对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖及成骨、成脂分化的影响，对其健脾作用的有效部位进行初步筛选。方法 采用全骨髓贴壁筛选培养法分离BMSCs，给予健脾活骨方不同提取部位（水、氯仿、正丁醇和乙酸乙酯萃取部位）作用一定时间后，MTS法检测细胞增殖，碱性磷酸酶（ALP）染色检测ALP活性，茜素红（ARS）染色检测钙结节的形成，油红O染色检测脂肪细胞的形成。结果 健脾活骨方不同提取部位均能不同程度促进BMSCs的增殖，其强度依次为水、氯仿、正丁醇和乙酸乙酯部位；ALP染色结果显示，促进ALP表达的强度依次为水、乙酸乙酯、氯仿和正丁醇部位；ARS染色结果显示，促进钙结节的形成作用强度依次为水、氯仿、正丁醇和乙酸乙酯部位；油红O染色结果显示，抑制脂肪细胞形成的作用强度依次为乙酸乙酯、水、氯仿和正丁醇部位。结论 健脾活骨方不同提取部位对BMSCs增殖和分化的影响不同，水部位促进增殖和成骨分化作用最强，乙酸乙酯抑制脂肪细胞形成作用最佳。
关键词：健脾活骨方；骨髓间充质干细胞；细胞增殖；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.018
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）07-0063-05
Effects of Different Extracts of Jianpi Huogu Formula on Proliferation and Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells LI Xiao-min1， KONG Xiang-ying1， ZHANG Cun1， WAN Hong-ye1， ZHU Jia2， CHEN Wei-heng2， LIN Na1 （1.Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；2.Wangjing Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100102， China）
Abstract：Objective To observe effects of different extracts of Jianpi Huogu Formula （JPHGF） on proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cell （BMSCs）. Methods Whole bone marrow adherent was used to screen， culture， and isolate BMSCs. Extracts from different parts （water， chloroform， ethyl acetate and n-butanol parts） of JPHGF were administrated for a certain time. MTS was used to detent cell proliferation；ALP staining was used to detect ALP activity；ARS staining was used to detect the formation of calcium nodules；oil red O staining was used to detect fat cell formation. Results Extracts from different parts of JPHGF could promote cell proliferation of BMSCs in different levels， followed by its strength in water， chloroform， ethyl acetate， and n-butanol parts；ALP staining results showed that the intensity of ALP expression of the order is water， acetic acid ethyl， chloroform and n-butanol parts；in promoting the formation of calcium nodules， ARS staining results showed that its intensity were water， chloroform， ethyl acetate， and n-butanol parts；oil red O staining results showed that inhibition intensity of fat cells interaction strength was formed from ethyl acetate， water， chloroform to n-butanol parts. Conclusion Extracts from different parts of JPHGF have different effects on BMSCs proliferation and differentiation. Water extraction has the strongest osteogenic differentiation and proliferation， and ethyl acetate has the best effect on the inhibition of cell formation.
Key words：Jianpi Huogu Formula；BMSCs；cell proliferation；rats
基金项目：国家自然科学基金面上项目（81173417）
通讯作者：林娜，E-mail：linna888@163.com
股骨头坏死是由多种原因引起股骨头供血障碍而导致的骨细胞及骨髓成分死亡及随后修复的病理过程，是骨伤科的一种常见难治性疾病。近年来研究显示，激素性股骨头坏死的发生与骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨和成脂分化失衡相关[1]。BMSCs是成骨细胞和成脂细胞的共同的前体细胞源，即在一定条件下，既可以向成骨也可以向脂肪细胞分化。BMSCs向成骨细胞与脂肪细胞分化的平衡维系着髓内骨组织与脂肪组织量的平衡，BMSCs成骨分化与成脂分化互为“倒数”关系，一旦BMSCs过多地向脂肪细胞分化，则向成骨细胞分化的细胞数相应减少，进而引起成骨缺陷。健脾活骨方（JPHGF）是中国中医科学院望京医院陈卫衡主任医师治疗早中期股骨头坏死的临床经验方，临床疗效良好[2]。为了进一步明确其药效物质基础，本研究观察其不同提取部位（水、氯仿、正丁醇和乙酸乙酯萃取部位）对大鼠BMSCs增殖、成骨和成脂分化的影响，为临床应用和新药研发提供实验依据。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级SD大鼠，雄性，4周龄，体质量80～100 g，解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物许可证号SCXK-（军）2012-0004。分笼饲养，室温20～24 ℃，湿度60%～70%，自由饮水饮食，明暗周期12 h/12 h。
1.2 主要试剂与仪器
L-DMEM，Hyclone；BMSCs培养基、BMSCs成脂分化培养基，ScienCell；地塞米松、β-磷酸甘油、L-抗坏血酸，Sigma；戊酸雌二醇（E2），法国拜尔公司；MTS，Promega；0.25%胰酶，Gibco；BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒，碧云天生物技术研究所；茜素红（ARS）、油红O染液，Sigma。生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司），倒置显微镜（重庆光电仪器有限公司），CO2培养箱（上海力申科学仪器有限公司），MK3型全自动酶标仪（Thermo公司）。
1.3 药物
健脾活骨方药物组成：茯苓15 g，桂枝10 g，甘草6 g，麸炒白术15 g，法半夏10 g，党参20 g，当归10 g，川芎10 g，熟地黄15 g，赤芍12 g，鹿角胶（烊化）20 g，土鳖虫10 g。饮片购自北京同仁堂药店。
2 实验方法
2.1 健脾活骨方不同萃取部位制备
按处方比例称取饮片，10倍量水煎煮2次，每次1 h，合并水煎液，浓缩液60%乙醇沉淀，静置48 h，离心，取上清液，减压浓缩。鹿角胶以适量热水烊化后并入上述浓缩液中，混匀后以系统溶剂萃取分离，分别得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取部位。用L-DMEM培养液制成含原药材1 g/mL的药液，稀释成100 mg/mL储存液，备用，-20 ℃保存。
2.2 骨髓间充质干细胞分离与培养
大鼠脱颈处死，浸于75%乙醇中，剪开大腿内侧，剥离皮肤和肌肉，暴露股骨和胫骨，浸于75%乙醇中，无菌条件下剪开股骨和胫骨两端，使骨髓腔暴露，用含有10%血清的BMSCs培养基，冲洗骨髓腔3遍，细胞筛过滤，接种于25 cm2培养瓶中，放入5%CO2、95%空气、37 ℃、饱和湿度孵箱培养，待细胞长至80%～90%融合时，0.25%胰酶消化，传代，3～5代细胞用于后续实验。
2.3 骨髓间充质干细胞增殖水平检测
取第3～5代BMSCs，0.25%胰酶消化成单细胞悬液后，4×103个/孔密度接种于96孔板。待细胞长至60%～70%时，加不同浓度JPHGF的不同提取部位（终浓度分别为10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2 mg/mL），将加入同体培养基孔设为对照组。48 h后每孔加MTS 20 µL，继续培养4 h，在酶标仪波长492 nm处测吸光度（OD值）。
2.4 骨髓间充质干细胞成骨诱导分化
选择第3～5代BMSCs，4×103个/孔密度接种于96孔板中，细胞贴壁生长24 h后，换为成骨诱导培养基（含10%胎牛血清，0.1 μmol/L地塞米松，50 μmol/L L-抗坏血酸，10 nmol/L β-磷酸甘油的L-DMEM）进行诱导培养，并同时给予不同浓度JPHGF的不同提取部位（终浓度分别为10-6、10-5、10-4 mg/mL），将加入同体培养基孔设为对照组。每3 d换液1次。
2.5 碱性磷酸酶染色
细胞成骨诱导第7日时进行碱性磷酸酶（ALP）染色。弃培养基，PBS冲洗2遍，4%多聚甲醛固定15 min， PBS冲洗2遍，加BCIP/NBT染色液，避光反应10 min，镜下观察并采集图片。每孔加入200 μL PBS避光反应15 min，在酶标仪405 nm处检测其OD值。
2.6 茜素红染色
细胞成骨诱导第14日时进行ARS染色。弃培养基，PBS冲洗2遍，4%多聚甲醛固定15 min，PBS冲洗2遍，加ARS染色液，避光反应10 min，镜下观察并采集图像。10%氯化十六烷基吡啶37 ℃洗脱15 min，在酶标仪595 nm处检测其OD值。
2.7 骨髓间充质干细胞成脂诱导分化
选择第3～5代BMSCs，4×103个/孔密度接种于96孔板中，细胞贴壁生长24 h后，换为MADM进行成脂诱导分化，同时给予不同浓度JPHGF的不同提取部位（终浓度分别为10-6、10-5、10-4 mg/mL），将加入同体培养基孔设为对照组。每3 d换液1次。
2.8 油红O染色
细胞成脂诱导第14日时进行油红O染色。弃培养基，PBS冲洗2遍，4%多聚甲醛固定15 min，PBS冲洗2遍，加入油红O染色液，避光反应10 min，镜下观察并采集图像。100%异丙醇在37 ℃洗脱15 min，595 nm处检测其OD值。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间计量资料比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 健脾活骨方不同提取部位对骨髓间充质干细胞增殖的影响
JPHGF 4种不同提取部位（水、氯仿、正丁醇和乙酸乙酯部位）对BMSCs的增殖均有显著的促进作用，表现为OD值显著增高，其中水和氯仿部位在10-6～10-2 mg/mL范围内，呈明显浓度依赖性（P<0.05，P<0.01，P<0.001）；而正丁醇部位在10-6～10-4 mg/mL范围内，浓度依赖性较好，随浓度增加，促增殖作用有所下降；乙酸乙酯部位的在10-6～10-2 mg/mL范围内，量效关系不明显。为比较各种提取物对BMSCs的效应，选择10-6～10-4 mg/mL范围作为观察浓度，结果见图1。
注：con为对照组；与con比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001
图1 JPHGF不同提取部位BMSCs增殖比较（492 nm）
4.2 健脾活骨方不同提取部位对碱性磷酸酶活性的影响
成骨分化培养基可以显著促进ALP染色阳性细胞的产生，经定量检测，JPHGF 4种不同提取部位对BMSCs增殖均有不同程度的促进作用，其中水和乙酸乙酯部位在10-6～10-4 mg/mL范围内可以浓度依赖性地促进ALP的表达，其中水部位更显著，在10-6 mg/mL即可显著发挥促进作用（P<0.05）；氯仿和正丁醇部位观察浓度范围内，量效关系不显著。结果见图2。
注：A.ALP染色结果（×50），con为对照组，OI为成骨诱导组；
B.ALP染色定量统计（405 nm）。与con比较，###P<0.001；与OI比较，
*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001（下同）
图2 JPHGF不同提取部位BMSCs成骨分化ALP活性比较（405 nm）
4.3 健脾活骨方不同提取部位对骨髓间充质干细胞成骨分化中钙结节形成的影响
为进一步验证其结果，通过ARS染色观察JPHGF不同提取部位对BMSCs成骨分化中钙结节形成的影响。结果与ALP染色基本吻合，水和氯仿部位在10-6～10-4 mg/mL范围内呈浓度依赖性地促进ALP表达，其中水部位更显著，在10-6 mg/mL即可显著发挥促进作用（P<0.05）；正丁醇和乙酸乙酯部位仅在10-4 mg/mL才发挥促进作用。结果见图3。
4.4 健脾活骨方不同提取部位对骨髓间充质干细胞成脂分化的影响
油红O为脂溶性染料，在脂肪内能高度溶解，可特异性的使三酰甘油等中性脂肪着色；因此，油红O作为脂肪细胞的特异性染色方法。经成脂分化培养基诱导后，见橙红色阳性颗粒。水和乙酸乙酯部位在10-6～10-4 mg/mL范围内阳性细胞数降低（P<0.05，P<0.01），其中乙酸乙酯部位呈现有浓度依赖趋势。氯仿和正丁醇部位作用不显著。结果见图4。
注：A.ARS染色结果（×50）；B.ARS染色定量统计（595 nm）
图3 JPHGF不同提取部位BMSCs成骨分化中钙结节比较
注：A.油红O染色结果（×50）；B.油红O染色定量统计（595 nm）；
AI为成脂诱导组，Sim为辛伐他汀组。与con比较，###P<0.001；
与AI比较，*P<0.05，**P<0.01
图4 JPHGF不同提取部位BMSCs成脂分化比较
5 讨论
股骨头坏死属中医“骨蚀”“骨痹”“骨痿”等范畴，病机主要为脾虚生痰，由痰致瘀，因瘀致痹。根据这一病机，以“痰瘀同治”为治则，以JPHGF用于治疗早中期非创伤性股骨头坏死，取得良好疗效[3-4]。前期实验研究表明，JPHGF可有效调节脂代谢，明显降低实验性股骨头坏死动物的骨髓腔脂肪细胞面积和空骨陷窝率，发挥显著的股骨头坏死防治作用[5-6]。然而，该方的药效物质基础尚不清楚，这在一定程度上影响了对其作用机制的认识和进一步的新药研究开发。
近年来，有学者采用BMSCs移植治疗股骨头缺血性坏死，取得较好的疗效[7]。但BMSCs移植治疗的安全性、有效性、载体的选择等问题还有极大的限制性，而内源性BMSCs的调控则显示其优越性。因此，药物对于内源性BMSCs的调节成为目前抗股骨头坏死研究的靶点。我们前期研究显示，JPHGF可以抑制成脂关键因子PPARγ以及调控Wnt3a/LRP5/β-catenin信号通路[8]。基于此，本实验通过建立体外BMSCs增殖和分化研究平台，根据药物组成及临床应用情况，选择水、氯仿、正丁醇和乙酸乙酯萃取部位的制备方法，对JPHGF发挥股骨头坏死防治作用有效部位进行初步的筛选，并探讨其可能的机制。
实验结果显示，JPHGF不同提取部位对BMSCs增殖、成骨及成脂分化均有一定的影响，但作用强度不同，其中水部位可以浓度依赖性地促进BMSCs增殖和成骨分化，抑制成脂分化；乙酸乙酯部位可以显著抑制成脂分化，还可以明显促进成骨分化；氯仿提取部位促进BMSCs增殖方面作用比较突出，而氯仿和正丁醇提取部位对成骨和成脂分化的调节作用均不显著。也就是说，水提取部位在促进BMSCs增殖和成骨分化方面较优，而乙酸乙酯提取部位则重在抑制成脂分化方面。究其原因可能与不同溶剂分离部位的化学物质组成存在明显差异相关，本研究结果初步提示，以水提取部位综合作用最佳，为不同提取方式侧重不同的治疗方向给予一定的提示。
参考文献：
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