摘要 近年来由于漆酶在生物漂白和农作物秸秆利用等方面具有广阔的应用前景，对漆酶的研究越来越受到国内外学者的重视。然而，自然界漆酶的产量和酶活较低，难以适应工业化生产需求。此外，漆酶的产酶效率低，成本高。实现漆酶的异源高效表达是解决这一问题的有效途径。目前，国内外已有多种来源的漆酶基因被成功克隆，并在不同的宿主细胞中实现异源表达，但迄今为止漆酶基因异源表达结果仍然不理想，离真正实现漆酶的高效表达还有一定距离。
关键词漆酶；宿主细胞；异源表达；基因克隆；酶活性
中图分类号S188文献标识码
A文章编号0517-6611（2016）01-018-04
AbstractIn recent years， due to laccase has broad application prospects in biobleaching and farming straw utilization， research of laccase has been paid more and more attention by domestic and foreign scholars.However， yield and enzyme activity of laccase in nature is difficult to meet the requirements of industrial production.Moreover， the production efficiency is low and cost is high， heterologous expression is an effective way for solving this problem.Currently， a variety of different sources of laccase gene are successfully cloned and expressed in different host cells.So far， the heterologous expression of laccase gene is still unsatisfactory， and there is a certain distance for realizing high efficient expression of laccase.
Key wordsLaccase； Host cells； Heterologous expression； Gene cloning； Enzyme activity
漆酶（laccase，Ec1.10.32）属于含铜的多酚氧化酶，能有效降解自然界中木质素等复杂有机物。真菌和植物中都可以分泌漆酶，少数的昆虫和细菌也可以分泌漆酶，而真菌是漆酶的主要生产者。它通过获得O2对苯酚物质进行催化作用，而生成物中仅有水。漆酶是一种不可多得的环保型氧化酶。漆酶是参与自然界木质素循环与利用的重要酶之一。漆酶对富含木质素的农作物残渣的有效降解作用不仅可以减少秸秆焚烧带来的环境问题，而且可以提高青贮饲料的品质和利用率，对与木质素结构相似的污染物也有明显的降解能力。据统计，漆酶有作用底物250多种[1]1。漆酶的底物多样性决定了它是一种多功能氧化酶。它在工业、农业及食品工业都有着极其广泛的应用。近年来研究表明，漆酶在生物技术方面也有重要的作用，可用于生物传感器与生物检测。然而，野生菌株的漆酶活力比较低。自然界中绝大多数能够生产漆酶的真菌都受到产量低、不易操作、成本高等因素的限制而难以适应商业化生产。漆酶高温易失活，也阻碍了它的实际应用。如何生产廉价、高效率且活力高的漆酶越来越受到国内外众多学者的关注。对漆酶基因进行改造，实现漆酶的异源高效表达是解决这一问题的有效途径之一。笔者对近年来漆酶基因克隆异源表达及其酶活性研究的最新进展进行综述。
1漆酶基因的克隆
随着分子生物学的发展，人们对漆酶基因的研究已迈入分子水平。不同来源的漆酶基因得到克隆且进行了性质分析及鉴定。有研究表明，多种基因克隆技术已被用于漆酶基因的克隆。漆酶基因的克隆技术有聚合酶链式反应（PCR）、逆转录-聚合酶链反应（RTPCR）、外显子拼接技术、cDNA文库技术、RACE技术、基因组文库探针杂交筛选法、染色体步移技术和表达文库抗原筛选法，其中应用广泛的是RTPCR技术。RACE技术和染色体步移技术是新型的技术手段，其中RACE技术是以RNA为模板，但是RNA在试验过程中极易被污染降解，而且由于其技术主要是PCR扩增，所以可能出现碱基序列突变；染色体步移技术以DNA为模板，有效地避免了RNA易被降解这一缺点[2]。郑苗苗[3]采用简并PCR、RTPCR、RACE、染色体步移方法从偏肿革裥菌的成熟菌丝中克隆得到漆酶同工酶cDNA全长基因。1988年Frohman等[4]最早利用cDNA快速扩增技术将poxI基因成功克隆。随后，很多研究者采用RTPCR技术克隆得到漆酶基因。随着基因克隆技术的不断发展，很多新型基因克隆技术与策略也被用于漆酶基因的克隆。洪宇植[5]将漆酶保守序列引物扩增法与长距离反向PCR技术相结合，建立了一种漆酶基因的新型克隆体系，高效扩增出野生革耳漆酶的DNA片段的侧翼序列。该方法较传统的反向PCR高效、简便、特异，能够解决扩增片段短、假阳性多的不足[7]。也有学者将RTPCR和RACE技术相结合，克隆到灰树花漆酶基因[6]。不同来源的漆酶保守性较低，但是铜离子结合区相对保守。郑邦晓等[7]通过保守引物CuI和CuIV从Cerrena spHYB07中克隆出包括CuI和CuIV保守结合位点在内的1 587 bp的保守序列，再用TAILPCR方法克隆侧翼序列。漆酶具有高度保守的铜离子结合区和N末端糖基化位点。路运才等[8]根据漆酶基因的这种特点，利用同源克隆技术，在玉米的基因中找到与黑麦草漆酶基因的同源片段，并且成功克隆。这为玉米漆酶全长的克隆及对饲用玉米的改良奠定基础。冯宝珍等[9]利用同源克隆法，从辣椒疫酶基因组克隆了漆酶基因Pclac3。该基因与已知真菌漆酶具有较高的同源性，也具有漆酶基因的保守序列。孙静[10]7采用大量重叠的引物，并且通过基于两步PCR的DNA合成法（PDTS）进行GILCC全基因的合成。该方法简单且易操作，不需要对引物进行磷酸化处理，而且可以较便利地获得大量的引物。
此外，还有很多学者通过建立基因组文库或cDNA文库，采取设计探针筛选基因的方法克隆基因。Coll等[11]运用基因组文库和cDNA文库克隆到担子菌PM1漆酶基因。
2漆酶基因表达载体的构建和转化
基因表达载体的构建需先用同一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶将二者连接，形成DNA分子，然后将目的基因转入受体细胞。常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等。漆酶基因进行异源表达时通常采用微生物作为受体细胞。这是因为它繁殖快，遗传物质相对较少。据报道，应用于漆酶遗传转化的方法有PEG介导的原生质体转化、电激转化、基因枪转化、限制性内切酶介导转化、农杆菌介导转化[12]。其中，最常用的为电激转化法。该方法具有简便、快速、转化效率高等特点。洪玉[13]利用随机插入策略，用瑞氏木霉的编码基因cbh1启动子pcbh1控制栓菌漆酶基因LacA构建基因表达载体PCGlacA，直接随机整合入瑞氏木霉中进行异源表达。孙静等[10]13-14将带有GILCCI的基因的表达载体pYM7909通过点击转化的方法转化进酵母细胞内。
安徽农业科学2016年
3漆酶基因的异源表达
近年来，随着分子生物学技术的发展，多种来源的漆酶基因已得到克隆，并在不同的宿主细胞中成功表达。目前为止，漆酶的异源表达宿主细胞既有原核生物又有真核生物，而真核宿主细胞占主要地位。其中，作为漆酶基因的真核宿主细胞成功表达的有毕赤酵母（Pichia pastoris）、酿酒酵母（Brewers yeast）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）[14]、银耳芽孢（Tremella spore）、丝状真菌瑞氏木霉（Trichoderma reesei）等。有学者已将漆酶基因在烟草植物中成功实现异源表达[15]。目前，漆酶基因在原核细胞中实现表达的却只有大肠杆菌（Escherichia coli）和乳酸菌（Lactic acid bacteria）[16]。在该试验前期，已成功实现漆酶在乳酸菌中的异源表达。目前，阳性重组子的酶学和产酸特性的研究工作尚在进行中。
毕赤酵母表达系统是目前使用最为广泛的异源蛋白真核表达系统。大多数漆酶基因的异源表达都在酵母中完成。该表达系统不仅具有原核表达系统操作优点，而且具有真核表达系统的优质性[17]。由于酵母是单细胞生物，操作简单而生长速度较快，可进行高密度发酵培养；酵母对培养基营养成分的要求低，生产成本低，便于工业化生产；毕赤酶母表达系统遗传表达的稳定性较强；AOX启动子控制下的外源基因能得到严格的高效表达；酵母不含病原体、热原体和病毒包涵体，且具有真核细胞的翻译后修饰功能，可对外源基因翻译后进行正确的加工和修饰[18]。然而，毕赤酵母表达系统也有其局限性，如信号肽加工不完全等，但这不足以阻挡它成为最具优势的异源表达系统[19]。
大肠杆菌表达系统是研究最早、应用最广泛的原核生物表达系统，也是异源基因表达的重要工具。相对于真核表达系统，它具备以下优势：①宿主的遗传背景及其生理特性比较清楚，已有不同抗性的菌种可供选择，易于控制[20]；②繁殖能力强而快，大规模生产成本低，具有巨大的工业化应用潜力。杨建强等[1]68-70首次尝试将野生革耳漆酶基因在原核表达系统大肠杆菌中实现表达。这是首次报道真菌来源的漆酶基因在原核表达系统中成功实现表达。Salony等[21]将黑蛋巢菌属（Cyathus bulleri）产生的漆酶成功地在原核宿主细胞大肠杆菌中实现异源表达。在密码子偏好性使用频率上，与枯草芽孢杆菌和毕赤酵母相比，大肠杆菌与漆酶的密码子用法差异最小，因此大肠杆菌更适合作真菌漆酶的异源表达宿主细胞[22]。也有研究表明，在大肠杆菌系统中虽然能大量产生重组蛋白，但由于在这种系统中不能对重组蛋白进行二级结构修饰，所以重组蛋白没有经过糖基化或空间修饰，进而失去酶活性[23]。
乳酸菌是益生菌，较其他宿主细胞而言是安全级的宿主细胞。它在表达外源基因的过程中不会产生内毒素，是近年发展起来的高效食品级异源基因表达的宿主细胞。自2007年以来，很少有漆酶基因在原核宿主细胞中成功表达。2014年，杏鲍菇漆酶基因成功地在原核宿主细胞乳酸菌中实现异源表达，其遗传稳定性还有待探究。
植物也可以作为漆酶基因的异源表达载体。在植物中表达和分泌的漆酶能够参与植物修复系统，而且能够帮助土豆抵御细菌性病原体的侵害。漆酶基因在农作物中的表达可提高农作物抗性。2002年Li等[24]把土豆漆酶基因以35S启动子控制接入西红柿中，成功表达地转基因西红柿抗病性能明显提高。上海生命科学研究院植物生理生态研究所实验室将棉花的漆酶基因转入拟南芥中实现过量表达。研究表明，转基因拟南芥对酚酸类物质的抗性得到显著增强。越来越多的研究者在实现漆酶基因异源表达的同时，期望能得到转基因的植物或转基因工程菌，不仅能解决漆酶产量的问题，而且能获得具有漆酶功能的转基因生物，为工业化生产奠定理论基础。表1为近年来已实现异源表达的部分漆酶基因。
漆酶基因的克隆及序列分析的主要目的是实现漆酶的高效表达。真菌漆酶培养时间过长、过程易污染等条件限制难以实现工业化生产。利用基因工程技术获得漆酶的高产菌株是实现漆酶高效表达的有效途径。到目前为止，已有多种来源的漆酶成功实现异源表达，但还仅限于实验室研究，未能投入到工业化生产。
并不是所有的漆酶基因转入载体细胞后都能够表达。2014年阳经慧[31]将从草菇中分离到的6个漆酶基因分别命名为vvlac1、vvlac4、vvlac5、vvlac6、vvlac8、vvlac9，电转化入毕赤酵母中，对重组子进行酶活筛选，发现仅带有vvlac6的转化子具有酶活。转化后的重组子可以通过含有适量的愈创木酚或ABTS的平板培养基进行初筛，成功表达的重组子在含有愈创木酚的培养基中菌落周围会出现微红棕色，而在含有ABTS的培养基中菌落周围会出现墨绿色。对于有颜色变化的菌落，可经过菌落PCR复筛。当PCR产物与目的基因相同时，表明漆酶基因成功表达。
4漆酶活性的测定和分析
测定漆酶活性是评价重组子异源表达漆酶性能的常用方法。漆酶是单电子氧化酶，其作用底物非常广泛。不同来源的漆酶对底物的亲和力不同，因此漆酶作用底物有多种。按结构，漆酶可分为酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、羟酸及其衍生物、生物色素、金属有机化合物、其他非酚类底物六类。测定漆酶活力的方法有测O2法（较早的测漆酶活力方法）、高效液相色谱法（HPLC法）、测压法、微量热法、脉冲激光光声法、分光光度计法、级谱法等[32]。在这些方法中，被广泛采用的方法为分光光度计法。该方法操作简便、快捷，近年来受到众多学者的青睐。
分光光度计法常见的作用底物有丁香醛连氮、苯胺蓝、愈创木酚、（2，2-联氮基双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐）（ABTS）、邻联甲苯胺、二茂铁。其中，以ABTS为底物测定漆酶的活性是目前国内外学者最常用的方法。ABTS易溶于水且反应只有一步，其阳离子自由基在水溶液中呈浅蓝绿色且较稳定，漆酶分解ABTS的产物在420 nm处的吸光系数远大于底物ABTS[33]10，其吸光系数为3.6×104 L/（mol·cm）。
以愈创木酚为底物时反应的时间较长，酶活力低，但反应较稳定。这与该反应的米氏常数较大有关。在465 nm处测定其吸光值，摩尔消光系数为4.8×104 L/（mol·cm），目前应用也比较广泛。当以丁香醛连氮为底物时，酶活力较高，且由于丁香醛连氮的摩尔消光系数很大，达6.5×104 L/（mol·cm），灵敏度也很高，且抗干扰性好，但当底物和酶液量较大时，反应不太稳定，需以冰浴来终止反应，而酶活力会明显低于不用冰浴时。 以邻苯甲胺为底物时，酶活较低，而且该底物的水溶性不太好，故不宜采用。以二茂铁为底物测定漆酶活性，准确度十分精准。这种检测方法没有多余的物质干扰，简单，高效，但是在国内应用不高，所以不常被人们用作生物酶的活性检测。
重组漆酶的活性除了与来源有关外，还受到温度、pH、金属离子浓度的影响。据报道，温度、pH影响漆酶的表达，而Cu2+影响漆酶的表达活性。真菌漆酶最适pH随着反应底物的不同而变化。多数真菌漆酶为酸性蛋白，最适pH一般在3.0～6.0之间。同一种来源的漆酶对不同反应底物的最适温度也有差异。大多数真菌漆酶的最适反应温度在40～60 ℃之间，但其耐热性均较差。此外，大量研究表明，适当浓度的Cu2+对漆酶活性有较大的促进作用，而且能提高漆酶稳定性。若浓度过大，则漆酶活性反而下降。外界条件影响漆酶活性，其生物量并没有发生变化。其他金属离子如Mn2+、Na+、Zn2+、Ca2+、Fe3+、K+、Ba2+、Al3+、Fe2+、Mg2+等对漆酶活性均有一定的影响，但是不同的金属离子对不同来源真菌漆酶活性的影响有一定的差异，即使同一种金属离子对不同来源的漆酶作用也有不同[33]35-44。漆酶来源很多，序列多变，结构各异，导致不同来源的漆酶表现出来的催化特性如催化氧化能力、最适pH、底物专一性和稳定性相差较大。
虽然已有多种漆酶成功实现异源表达，但是大多数重组漆酶的产量低于1.0×104 U/L，依旧难以满足工业化生产需求[34]。重组漆酶活性较低，可能与宿主细胞的密码子偏好性、信号肽的作用和培养条件等因素有关。表2为近年来已实现异源表达的部分漆酶重组子的活性。
5展望
漆酶是一种具有广泛工业化用途的酶，是自然界中为数不多的木质素降解酶之一。漆酶的应用需要大量廉价且生产周期短的酶制剂。在自然界中，白腐真菌是漆酶的主要生产者，但野生型真菌的漆酶产量较低，培养周期长，因此限制了漆酶的大量生产和广泛应用，难以满足工业化的生产。如何实现漆酶的高效表达越来越受到国内外学者的重视。随着分子生物技术和基因工程的快速发展，在分子水平上研究漆酶逐渐发展起来。国外对漆酶分子学研究得比较深入。很多种漆酶基因得到克隆，并且对其进行了分析和鉴定。目前，已有一些不同来源的漆酶在异源真核和原核系统中实现表达。研究漆酶异源表达，探究如何实现漆酶异源高表达，为漆酶大规模的生产和广泛应用提供理论依据，使得漆酶向工业化生产又迈进了一步。但是，目前漆酶的异源表达仍不理想，还未能真正实现漆酶的高效表达且达到工业化生产需求，还需要更进一步的研究。加强分子生物学和分子遗传学邻域的研究，更深入地了解漆酶基因的结构、功能，进而实现在基因水平对漆酶进行改造和优化，真正实现漆酶的高效异源表达。
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