[摘要] 目的 探讨绞股蓝皂苷（GPs）对痴呆小鼠认知能力的作用及其机制。 方法 联合使用三氯化铝、D-半乳糖和亚硝酸钠复制阿尔茨海默病（AD）小鼠模型；按照随机数字表法分为：AD模型组、GPs 50 mg/kg组、GPs 150 mg/kg组、GPs 250 mg/kg组、安理申组及正常组；3个GPs组给予不同剂量的GPs，连续给药3个月，观察各组抗氧化指标和形态学染色的差异。 结果 GPs 250 mg/kg组与AD模型组、GPs 150 mg/kg组比较，潜伏期、第一次穿越原平台位置时间明显缩短（P < 0.05或P < 0.01），而在原平台象限的活动时间明显变长（P < 0.05或P < 0.01），且接近正常组（P > 0.05）。与AD模型组比较，GPs 150 mg/kg组、GPs 250 mg/kg组超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）活性依次升高（P < 0.05），而丙二醛（MDA）含量依次降低（P < 0.05）；且GPs 250 mg/kg组上述三个指标接近正常组（P > 0.05）。HE染色：AD模型组海马CA2区锥体细胞数量少、排列不整齐，结构模糊，而GPs 250 mg/kg组神经元数量多，排列较均匀、整齐，结构较清晰。 结论 GPs通过抗氧化等作用保护海马神经元，从而改善痴呆小鼠的认知能力。
[关键词] 阿尔茨海默病；绞股蓝皂苷；抗氧化；学习记忆
[中图分类号] R749.16；R-332 [文獻标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）05（a）-0017-04
Function and its mechanism of gypenoside on improving cognitive competence of dementia mice
LIU Meixun1 SUN Tianmin2
1.Medical Imaging Center， Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China； 2.Library， Hubei University of Medicine， Hubei Province， Shiyan 442000， China
[Abstract] Objective To discuss function and its mechanism of Gypenosides （GPs） on improving cognitive competence of dementia mice. Methods Alzheimer"s disease （AD） mice model was copied by combining alchlor， D-galactose and sodium nitrite. According to the random number table method， these mice were divided into AD model group， GPs 50 mg/kg group， GPs 150 mg/kg group， GPs 250 mg/kg group， Aricept group and normal group randomly. Three GPs groups were injected with different doses of GPs for three consecutive months to observe the differences in anti-oxidative index and morphological staining pattern of the three groups. Results The incubation period and the time when the original platform position was passed through for the first time were shortened significantly （P < 0.05 or P < 0.01）， GPs 250 mg/kg group comparied with AD model group and GPs150 mg/kg group， the activity time in the original platform quadrant extended obviously （P < 0.05 or P < 0.01）， and it closes to the normal group （P > 0.05）. Comparied with AD model group， the SOD， GSH-Px activities of GPs 150 mg/kg group， GPs 250 mg/kg group rose respectively （P < 0.05）， and MDA concentration decreased （P < 0.05）， but the above four indexes of GPs 250 mg/kg group were approximate to the normal group （P > 0.05）. HE staining： the quantity of pyramidal cells in hippocampal CA2 sector decreased and arranged irregularly with an obscure structure. But there was a large amount of neuron in GPs 250 mg/kg group， which arranged evenly and orderly with a clear structure. Conclusion GPs protects hippocampal neuron by its anti-oxidability， further improving the cognitive competence of dementia mice.
[Key words] Alzheimer"s disease； Gypenosides； Anti-oxidability； Learning and memory
阿尔茨海默病（Alzheimer"s disease，AD），又称老年性痴呆，由德国医生Alois Alzheimer于1906年最先描述，是与年龄高度相关的、以进行性认知障碍为主要表现的中枢神经系统退行性疾病[1]。关于其发病机制，目前公认的是神经元外由β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）组成的老年斑（senile plaques，SP）和神经元内由异常磷酸化tau蛋白（p-tau）组成的神经原纤维丝缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）共同演绎着AD发生、发展的全过程[2]。但仍缺乏根治药物。绞股蓝皂苷（gypenosides，GPs）具有多种生理活性。前期同行研究发现，GPs能改善AD小鼠的学习记忆能力，同时减少脑Aβ和p-tau表达[2-3]。本课题组在前期研究的基础上，运用生化检测、形态学染色等方法进一步观察GPs对AD脑的影响，以阐明GPs对抗AD的主要机制，为其可能被开发成抗AD新药提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物与试剂
健康雄性昆明小鼠100只，SPF级，10月龄，体质重（40±5）g。由湖北醫药学院附属太和医院实验动物中心[许可证号：SCXK（鄂）2016-0008、SYXK（鄂）2016-0031]提供。用药前将小鼠适应性喂养2周，自由饮食，室温在20～22℃，相对湿度40%～70%，每日光照12 h，SPF；且采用跳台试验剔除逃避反应明显迟缓者。MT-200水迷宫行为学跟踪系统购于成都泰盟科技有限公司。GPs（陕西浩洋生物，纯度>98%），D-半乳糖（D-galactose；纯度>98%）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）试剂盒、谷胱甘肽过氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（武汉博士德）。
1.2 复制AD小鼠模型
联合使用三氯化铝、D-半乳糖和亚硝酸钠复制AD模型。①三氯化铝（40 mg/kg），按每只小鼠平均饮水5 mL/天配制液体，让小鼠自由饮用；②D-半乳糖（500 mg/kg）、亚硝酸钠（45 mg/kg），配成水溶液、颈背部皮内注射。均持续用药3个月。随后行Morris水迷宫测试，若定向航行实验第5天潜伏期>40 s，并随机抽取其中10%小鼠做病理学检查，出现海马神经元减少、Aβ斑或SP斑或神经原纤维变性甚至NFTs，则该批小鼠确定为AD动物模型，即成功复制小鼠AD模型。
1.3 分组与给药
AD模型制作成功后，取AD小鼠50只，按照随机数字表法分为5个组：AD模型组，GPs 50 mg、150、250 mg/kg组，安理申组，每组各10只；另取健康小鼠10只为正常组，共6组。3个GPs组给予相应剂量的GPs；安理申组按3 mg/kg给药；AD模型组和正常组给予同体积/体重的生理盐水。每天7：00～9：00灌胃，各组均连续给药3个月。
1.4 小鼠学习记忆能力的测试
①定位航行实验：连续进行5 d。每天每只小鼠接受3次训练，分别从不同象限的中点，头朝池壁入水、去寻找平台，记录每只小鼠找到并爬上平台的时间即潜伏期。训练开始时先让小鼠在目标平台上适应15 s。若小鼠在60 s内未找到平台，则计其潜伏期为60 s。小鼠无论找到平台与否，均安排其在平台上休息15 s，且间隔30 min后、进行下一轮训练。②空间探索实验：在定位航行实验结束后的第1天进行。除去平台，让小鼠自由寻找平台，时间30 s。记录每只小鼠在原平台象限活动的时间以及第一次穿越原平台位置的时间。
1.5 取材与染色
行为学测试完毕、即断头取脑：①靠近枕骨、将小鼠头剪断，放在已准备好的冰盘上，并用剪刀剪掉头后部的软组织；②沿中线由后向前剪开小鼠头皮，并将皮肤、皮下组织向两侧分离，暴露颅骨；③沿中线剪开枕骨、顶骨直至顶、额两骨分界处，用镊子将颅骨向两侧快速掀开；④轻轻将脑组织与颅骨分开，剪断与颅骨相连的脑神经、脑膜等软组织，取出全脑，从前囟后2.3 mm至前囟后6.3 mm处、切取大脑皮质和海马，用生理盐水清洗干净，放入液氮中保存。常规进行HE染色。
1.6 生化检测
从液氮中取出小鼠大脑皮质和海马，称量、剪碎，按质量与体积比（W/V）1∶9加入4℃生理盐水，采用电动匀浆机（离心半径22.5 cm，3000 r/min）制成10%大脑皮质、海马组织匀浆液，离心15 min，取上清液、分装在EP管中备用。按照SOD试剂盒、GSH-Px试剂盒、MDA试剂盒说明书严格操作，分别测定SOD、GSH-Px活性和MDA含量。
1.7 统计学方法
采用统计软件SPSS 22.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验。计数资料以率表示，采用χ2检验或确切概率检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组小鼠学习记忆能力的测试结果
2.1.1 学习能力检测 潜伏期越短，学习能力越强。随着训练的天数、次数增加，各组潜伏期均在缩短，其中正常组、GPs 250 mg/kg组缩短的幅度较大。到训练的第5天，正常组的潜伏期明显短于AD模型组（P < 0.01），GPs 150 mg/kg组、GPs 250 mg/kg组也明显短于AD模型组（P < 0.05或P < 0.01），尤其是GPs 250 mg/kg组（P < 0.01）。见图1。
2.1.2 记忆能力检测 穿越原平台位置的潜伏期越短或者在原平台象限活动时间长，表示记忆能力较强。第一次穿越原平台位置的时间，正常组明显短于AD模型组（P < 0.01），GPs 150 mg/kg组、GPs 250 mg/kg组也明显短于AD模型组（P < 0.05或P < 0.01），尤其是GPs 250 mg/kg组（P < 0.01）。见图2A。正常组在原平台象限的活动时间明显长于AD模型组（P < 0.01），GPs 150 mg/kg组、GPs 250 mg/kg组及安理申组在原平台象限的活动时间也明显长于AD模型组（P < 0.05或P < 0.01），尤其是GPs 250 mg/kg组（P < 0.01）。见图2B。
2.2 各组小鼠SOD、GSH-Px活性及MDA含量检测结果
与AD模型组比较，GPs 50 mg/kg组、GPs 150 mg/kg组、GPs 250 mg/kg组SOD、GSH-Px活性依次升高，而MDA含量依次降低；其中与后两组差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。但GPs 250 mg/kg组与正常组，GPs 50 mg/kg组与AD模型组，GPs 150 mg组与安理申组差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表1。
2.3 HE染色，观察神经元形态和数量的改变
正常组海马CA2区锥体细胞体积大、层次多、排列整齐，结构清晰，细胞核较大（图3A）。AD模型组海马CA2区神经元数量少、排列不整齐，结构模糊，细胞体积小，细胞浆深染，细胞核固缩（图3B）。安理申组海马CA2区神经元形态较AD模型组有明显的改善，但结构仍不十分清晰（图3C）。GPs 50 mg/kg组海马CA2区神经元结构有改善、但不明显（图3D）；GPs 150 mg/kg组海马CA2区结构明显改善，与安理申组相似（图3E）；而GPs 250 mg/kg组海马CA2区组织结构进一步改善，锥体细胞数量多，排列较均匀、整齐，结构较清晰（图3F）。
3 讨论
本实验联合使用三氯化铝、D-半乳糖和亚硝酸钠成功建立小鼠AD模型，其认知功能明显障碍，并产生AD部分病理特征，说明模型制作成功[4]。实验结果显示，对AD模型小鼠采用GPs低、中、高剂量连续灌胃3个月后，进行行为学测试。在定位航行实验中，随着訓练次数的增加，各给药组小鼠包括GPs 50 mg/kg、150 mg/kg、250 mg/kg组，安理申组的潜伏期均逐渐缩短，其中GPs 250 mg/kg组潜伏期变得最短；而在空间探索实验中，第一次穿越原平台位置时间、在原平台象限的活动时间，在GPs 250 mg/kg组分别是最短与最长，这说明给予250 mg/kg GPs更有利改善AD小鼠的空间学习记忆能力和空间记忆保持能力[5]。
实验结果进一步显示，AD模型组小鼠大脑皮质和海马组织中SOD、GSH-Px活性明显下降和MDA表达明显上升。这表明小鼠体内产生了脂质过氧化（lipid peroxidation，LPO），且氧自由基（ROS）已损伤脑组织。我们知道，SOD、GSH-Px均是体内十分重要的抗氧化酶，它们保护着皮质、海马等脑组织免受自由基等氧化因子的攻击；而MDA是脂质过氧化后的代谢产物，其浓度标志脂质过氧化的程度[6]。在正常情况时，ROS的产生与抗氧化酶的清除处于动态平衡状态。在AD模型制作过程中，三氯化铝毒性可导致小鼠细胞膜完整性的丧失，可通过损害膜结构及膜酶、介导脂质过氧化[7]；长时间注射D-半乳糖，其代谢产物半乳糖醇不能进一步代谢而堆积在细胞内，影响渗透压，引起细胞膜脂质过氧化，导致一系列氧化损伤[8]；亚硝酸钠的氧化性能将血红蛋白中的二价铁氧化成三价铁，失去携带、输送氧气功能，使机体组织产生缺氧性中毒[9]。尤其三者联合、持续作用，造成小鼠脑组织严重脂质过氧化，ROS大量增加，而抗氧化酶如SOD、GSH-Px浓度、活性持续降低，同时脂质过氧化产物如MDA浓度不断增高，从而打破了上述的这种平衡[10]。GPs是从绞股蓝中分离出来、与人参皂苷有类似骨架的达玛烷型绞股蓝皂苷，具有抗氧化、抗衰老、抗溃疡、抗癌、镇静、镇痛、降血脂等作用。本实验数据提示，GPs可提高痴呆鼠脑组织中SOD、GSH-Px活性，促进自由基清除，减轻自由基介导的脂质过氧化，同时降低MDA含量[11]。这样，就重新恢复了脂质过氧化与抗氧化损伤的平衡。
实验结果还显示，AD小鼠海马CA2区神经元数量少、排列零乱、结构模糊。这一病理改变，是三氯化铝、D-半乳糖和亚硝酸钠联合、持续作用的结果[12]。一是脂质过氧化作用：产生ROS连锁反应，损伤生物膜，神经细胞变性、坏死[13]；二是可能出现的Aβ斑或SP斑：由β淀粉样前体蛋白水解产生Aβ，并分泌、沉积在细胞外基质中形成，有神经毒性，它能使血管壁淀粉样变、硬化，甚至破裂或形成血栓，还能诱导神经元过早凋亡[14]；三是有可能产生的神经原纤维变性或NFTs：即过度磷酸化Tau蛋白形成，使神经原纤维退化、萎缩，大脑早老化，NFTs与临床痴呆程度密切相关[15]。这3个发生、发展过程单个或联合作用，均能导致神经元及其之间的突触丢失[16-19]。然而，GPs 250 mg组神经元数量多，排列较均匀、整齐，结构较清晰。这是GPs对抗脂质过氧化、从而减轻Aβ、过度磷酸化Tau蛋白表达的结果。由此，保护小鼠AD脑皮质和海马神经元，提高AD小鼠的认知能力[1-3，20]。
[参考文献]
[1] Zhao WH，Xu S，Peng Y，et al. Potassium 2-（1-hydroxypentyl）-benzoate improves learning and memory deficits in chronic cerebral hypoperfused rats [J].Neurosci Lett，2013，541（1）：155-160.
[2] 姚淞元，姚伟，黄琪，等.绞股蓝皂武改善MCI大鼠学习记忆能力的机制探讨[J].浙江临床医学，2014，16（7）：1033-1035.
[3] 姚柏春，袁华，黄翔，等.绞股蓝对海马注射Aβ1～40大鼠脑内细胞周期蛋白表达和钙稳态变化的影响[J].中国病理生理杂志，2006，22（8）：1618-1622.
[4] 赵波，张新宇，付学锋，等.阿尔茨海默病动物模型的研究进展[J].神经解剖学杂志，2012，28（1）：102-104.
[5] 胡江平，耿瑞，李凯军.tau蛋白与阿尔茨海默病的研究进展[J].中国康复理论与实践，2014，20（11）：1031-1034.
[6] 李岚，刘爽，于燕，等.阿尔茨海默病复合动物模型的构建[J].中国老年学杂志，2015，35 （23）：6685-6688.
[7] 赵万红，罗超，龚应霞，等.消旋丁苯酞对慢性脑缺血大鼠认知功能的影响及其生化机制研究[J].中华老年医学杂志，2014，33（4）：412-415.
[8] 秦红兵，杨朝晔，范忆江，等.D-半乳糖诱导衰老小鼠模型的建立与评价[J].中国组织工程研究与临床康复，2009， 13（7）：1275-1278.
[9] 加吾拉·阿不力孜，张忠，许红，等.10月龄APP/PS1双转基因AD小鼠海马超微结构特征的观察[J].神经解剖学杂志，2015，31（2）：181-186.
[10] 路兰红，李秀清，刘媛媛，等.D-半乳糖对SD大鼠记忆能力及海马区γ-氨基丁酸受體1和N-甲基-D-天冬氨酸2B受体表达的影响[J].河北医科大学学报，2016，37（5）：506-509.
[11] 贺燕，杜怡峰.纤丝状Aβ1～42与Aβ1～42寡聚体诱导阿尔茨海默氏病模型大鼠行为学、海马超微结构变化、炎症因子表达及海风藤的干预研究[D].济南：山东大学，2013.
[12] 姚维范，刘明妍，钟欣，等EGCG改善D-gal诱导阿尔茨海默病模型大鼠认知障碍机制研究[J].临床军医杂志，2016，44（6）：574-578.
[13] 徐志秀，喻超，陈俊俊，等.姜黄素对阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆能力、海马结构及脑脊液中Aβ1～42和tau蛋白含量的影响研究[J].军事医学，2016，40（2）：113-116.
[14] 赵燕燕，陈春生，刘新霞，等.运动训练对亚硝酸钠致记忆障碍模型小鼠学习记忆能力的影响[J].中国康复医学杂志，2009，24（2）：110-112.
[15] 董贤慧，贺小平，王学娟，等.三种中药有效成分复方对阿尔茨海默病转基因小鼠大脑皮质病理学及超微结构的影响[J].神经解剖学杂志，2016，32（2）：223-228.
[16] 杨光，高家明，叶蓉，等.运动训练对亚硝酸钠致记忆障碍模型小鼠学习记忆能力的影响[J].石河子大学学报：自然科学版，2014，32（4）：468-471.
[17] 贾建平，陆璐，张逸，等.美国国立老化研究所与阿尔茨海默病协会诊断指南写作组：阿尔茨海默病痴呆诊断标准的推荐[J].中华神经科杂志，2012，45（5）：352-355.
[18] 陶长秀，杨文明，汪美霞，等.阿尔茨海默病发病机制研究概览[J].中医药临床杂志，2015，27（10）：1370-1372.
[19] 郭静静，廖红.阿尔茨海默病治疗药物的研究进展[J].中国药科大学学报，2010，41（5）：395-400.
[20] 赵进，蔡兆伟，管峰，等.阿尔茨海默病与PRNP突变体小鼠动物模型[J].中国实验动物学报，2016，24（5）：541-545.
[21] 李子艳，马慧冬.阿尔茨海默病转基因小鼠的行为学检测方法[J].中国医药导报，2011，8（16）：113-115.
（收稿日期：2016-12-03 本文编辑：苏 畅）